细菌的分离培养及移植

实训三　细菌的分离培养及移植

一、目的要求

掌握细菌分离培养及移植的基本要领和方法。

二、仪器及材料

温箱、病料、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌平板及斜面培养物、接种环、酒精灯、无菌平皿、斜面培养基、手术刀等。

三、方法与步骤

（一）细菌的分离培养

1.平板的制备：按无菌操作要求，在火焰旁操作（图3），取融化并冷却至不烫手（约50℃）的固体培养基，倒入无菌培养皿中，约mm厚，平放桌上待其充分凝固，备用。

图3　倒平板的方法

2.分区划线分离法：

（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度（角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染）。

（2）右手持接种环于酒精灯上灼烧灭菌，待冷后，无菌操作取病料，若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将手术刀在酒精灯上灭菌，立即用其在病料表面烧烙灭菌，并在烧烙部位做一切口，然后用灭菌接种环从切口插入组织，缓缓转动接种环，取少量组织或液体。

（3）将取好材料的接种环伸入平皿，将材料划线涂布于培养基边缘，划完一区后，将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，从上一区划过再划第二区，如此连续划4～5区（图4）。

划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基；划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养h。

a.划线分离法b.分区划线分离法c.培养后菌落

图4　划线分离示意图

（二）细菌的移植

1.右手持接种环，烧灼待冷后，挑取平板（或斜面）上的单个菌落。

2.左手持斜面培养基管下端，以右手小指与手掌夹住塞子并拔出，将管口迅速通过火焰以灭菌。斜面向上，将接种环伸入管内，从斜面底部向上做“之”字形划线。

3.烧灼管口灭菌，塞好塞子，烧灼接种环。作好标记，置37℃温箱，培养18～h观察结果。

细菌的移植操作步骤见图5。

a.手持试管b.拔试管塞c.斜面接种

图5　细菌的移植操作示意图

（三）液体接种法

用于肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等液体培养基的接种。

用接种环从平板上挑取菌落，先在接近液面的试管壁上研磨，并蘸取少许液体培养基与之调和，使细菌均匀分布于培养基中，管口过火焰后加塞、标记，经37℃孵育18～h。由于菌种不同，可出现均匀混浊、沉淀生长或表面生长（形成菌膜）等不同的生长现象。

（四）厌氧菌的分离培养

分离培养厌氧菌常用焦性没食子酸平板法。用无菌接种环取菌，划线接种于一血平板上，然后取无菌玻璃板，中央放一小块纱布，纱布上放0.g焦性食子酸，用吸管加入mL 20％NaOH，立即将接种的平板倒扣覆盖于其上，并迅速用融化的石蜡封好平板与玻璃板之间的空隙，待封固后置37℃温箱中孵育h观察结果（图6）。

图6　焦性没食子酸法厌氧平板培养法

（五）穿刺接种

用接种针挑取菌落，于固体培养基的中心处向下垂直穿刺接种，直至试管底部上方mm左右（不能穿至试管底），接种后的接种针沿原穿刺线退出。管口过火焰后加塞、标记，经37℃孵育18～h，观察结果。