从土壤中分离纯化放线菌和真菌

实训36　从土壤中分离纯化放线菌和真菌

一、实训目的

（1）掌握分离纯化微生物的基本操作技术。

（2）从土壤中分离纯化得到放线菌和真菌的纯培养菌种，并进行显微鉴定。

二、实训原理

土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起的。当人们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂生活的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。

土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化得到许多有用的菌株。

三、实训器材

1．设备

超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，电炉，恒温水浴锅，生化培养箱。

2．仪器与用具

φ90mm培养皿，250mL锥形瓶，1mL吸管，试管，称量纸，玻璃珠，烧杯，玻璃棒，接种环。

3．培养基与试剂

高氏Ⅰ号琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，10%苯酚，1%链霉素，NaCl。

四、实训步骤

1．实训准备

（1）带有适量玻璃珠的90mL生理盐水2瓶，包扎，于121℃高压灭菌20min。

（2）φ90mm培养皿4个，包扎，于121℃高压灭菌20min。

（3）1mL吸管2支，包扎，于121℃高压灭菌20min。

（4）配制高氏Ⅰ号培养基100mL，分装5支试管，其余分装至250mL锥形瓶中。

高氏Ⅰ号培养基配方：可溶性淀粉20g；NaCl　0．5g；KNO₃1g；K₂HPO₄·3H₂O　0．5g；MgSO₄·7H₂O　0．5g；FeSO₄·7H₂O　0．01g；琼脂20g；蒸馏水1000mL；pH　7．2～7．4。

称量和溶解：按配方计算后，先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶解，再称取其他各成分依次逐一溶解。对微量成分FeSO₄·7H2O可先配成高浓度的储备液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO₄·7H2O配成0．01g／mL，再在1000mL培养基中加入1mL的0．01g／mL的储备液即可。待所有药品完全溶解后，补足水分到所需的总体积。

调pH：先用精密pH试纸（pH　5．5～9．0）测量培养基的原始pH，若偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol／L　NaOH溶液，边加边搅拌，并随时测其pH，直至pH达7．5。若偏碱，则用1mol／L盐酸调节。注意不要调过头。

分装：按实验要求可通过漏斗分装至试管中，分装量为管高的1／5，其余分装于锥形瓶中，分装量不超过锥形瓶容积的一半为宜。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免污染棉塞而引起污染。

加塞和包扎：培养基分装完后，在试管口和锥形瓶瓶口上塞上棉塞，外包牛皮纸，用线绳扎紧，用记号笔注明培养基名称、组别、日期等。

灭菌：将培养基置于121℃高压灭菌30min。

摆斜面：将灭菌的试管培养基冷至60℃左右，将试管斜搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

无菌检查：将灭菌培养基放入37℃温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。灭菌培养基上无菌落生长，则说明灭菌彻底，方可使用，否则应重新制备高氏Ⅰ号培养基。

（5）配制马丁氏培养基100mL，分装5支试管，其余分装至250mL锥形瓶中。

马丁氏培养基配方：KH2PO₄1g；MgSO₄·7H2O　0．5g；蛋白胨5g；葡萄糖10g；1%孟加拉红溶液3．3mL；琼脂20g；水1000mL；pH自然。

称量和溶解：按配方计算后，称取KH2PO₄、MgSO₄·7H2O、蛋白胨、葡萄糖依次溶解在适量蒸馏水中，补足水到1000mL，再加入1%孟加拉红溶液3．3mL，混匀后加琼脂加热熔化。

分装、包扎：同高氏Ⅰ号培养基。

灭菌：将培养基置于115℃高压灭菌20min。

摆斜面、无菌检查：同高氏Ⅰ号培养基。

临用时每100mL培养基加1%链霉素液0．3mL。

（6）称量纸4张包好，置于121℃高压灭菌20min。

（7）土壤取样。

分离放线菌土壤：取有机质丰富、透气性好的中性到微碱性土壤。

分离真菌土壤：取有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤。

2．操作步骤

1）采用划线分离法进行分离纯化

（1）超净工作台和用具照紫外光20～30min。

（2）将土壤研细，经孔径为2mm的筛过筛。

（3）分别称取分离放线菌和分离真菌两份土样各10g，放入两瓶装有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中，用手振摇或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，得10^－1稀释度的稀释液。

（4）高氏Ⅰ号琼脂培养基和马丁氏培养基分别置于微波炉中熔化，待冷至55～60℃，向每100mL高氏Ⅰ号琼脂培养基中加入10%苯酚数滴混匀，向每100m马丁氏培养基中加入1%链霉素溶液0．3mL混匀，使每毫升培养基中含链霉素30μg。

（5）分别将高氏Ⅰ号琼脂培养基注入2个培养皿，将马丁氏培养基注入2个培养皿，凝固后，用接种环挑取10^－1稀释度的土壤悬液进行划线方法分离。两种划线方法详见本模块实训15。

（6）培养：将高氏Ⅰ号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃培养箱培养3～5天。

2）挑菌纯培养

（1）观察并识别高氏Ⅰ号琼脂培养基平板上长出放线菌的单菌落，将不同种类的放线菌单菌落分别挑取接种到高氏Ⅰ号培养基斜面上，每个放线菌的单菌落接种到1支高氏Ⅰ号培养基斜面上，置28℃培养箱中培养3～5天，待菌苔长好。

（2）观察并识别马丁氏培养基平板上长出真菌的单菌落，将不同种类的真菌的单菌落分别挑取接种到马丁氏培养基斜面上，每个真菌的单菌落接种到1支马丁氏培养基斜面上，置28℃培养箱中培养3～5天，待菌苔长好。

3）纯培养的鉴定

（1）放线菌纯培养的鉴定：取分离得到的放线菌菌种斜面，先观察菌落形态，若呈干燥、不透明、表面呈致密丝绒状，上有一薄层“干粉”，菌落与培养基连接紧密，难以挑取，初步判定为纯种放线菌菌落后，采用印片法观察放线菌孢子丝、孢子的形态和孢子的排列情况，判断是否为纯培养。

（2）真菌纯培养的鉴定：取分离得到的真菌菌种斜面，先观察菌落形态，若呈绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状丝状菌体，初步判定为纯种霉菌菌落后，采用乳酸石炭酸棉蓝染色液制水浸片观察，判断是否为纯培养，是哪种霉菌的纯培养。

五、结果记录

（1）用彩图或彩照记录高氏Ⅰ号培养基平板上长出的放线菌单菌落的形态特征和马丁氏培养基平板上长出真菌单菌落的形态特征。

（2）描述高氏Ⅰ号培养基斜面上的放线菌纯培养和马丁氏培养基上的真菌纯培养的菌落形态和色泽（附彩图或彩照）。

（3）说明显微镜下观察分离得到的几种放线菌和真菌的微观形态（附彩图或彩照）。

（4）判断是否得到放线菌和真菌的纯培养，得到了几种放线菌和真菌纯培养。

六、思考题

（1）在交叉划线法中，为什么每划完一组平行线都须将接种环上的剩余物烧掉？

（2）本实训使用了哪些抑菌剂？分别起什么作用？为什么分离真菌时需加入链霉素，而不加青霉素？