灵菌红素的分离纯化与结构鉴定

一、目的要求

1．了解微生物发酵产物灵菌红素的理化性质及提取分离纯化工艺流程。

2．掌握薄层层析、柱层析技术以及UV、IR、HPLC、NMR结构表征技术。

3．掌握天然产物分离纯化以及定性定量分析技术。

4．要求按照教师给定的对照实验，进行自主的创新实验设计并进行工艺评价。

二、实验原理

灵菌红素（Prodigiosin，化学名：2-methyl-3-pentyl-6-methoxyprodiginine）是一种红色物质，可由黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）等细菌合成的次级代谢产物。化学结构是具有三吡咯环，其中的一个吡咯环C2上带有一个甲基，C3上则有一个戊基。但现在它已被发现具有多种生物活性作用，能抗癌，抗微生物，抗疟疾，抗霉，免疫抑制的作用。其中抗癌方面，因为其具有癌组织的高针对性和对正常细胞表现的低毒害作用，而成为一种非常有潜力的抗癌物质（图3-9-1）。

图3-9-1 灵菌红素结构式

灵菌红素易溶于乙醇、丙酮、苯等大多数有机溶剂，不溶于水。在空气中见光易变色。需要避光保存，灵菌红素的紫外—可见光谱的主要吸收峰为535 nm。

三、仪器与试剂

1．仪器

超声波提取器，旋转蒸发仪，恒温水浴锅，柱层析系统，UV2550紫外—可见分光光度计，安捷伦1200高效液相色谱（图3-9-2），纯水制备系统，傅里叶红外光谱仪，核磁共振波谱仪，元素分析仪等。

2．试剂

JX01 黏性沙雷氏菌菌株（CGMCC：4074），酵母膏，蛋白胨，甘油，丙酮，甲醇，乙醇等。

图3-9-2 高效液相色谱

四、实验设计工艺路线图

设计工艺路线如图3-9-3所示。

图3-9-3 设计工艺路线

五、实验操作与步骤

1．灵菌红素的发酵

活化菌种：优化的菌种（-80℃冰箱保存），经斜面活化后接入种子培养基，37℃ 180 r/min的摇床培养12 h。

种子培养基（g/L）：牛肉膏：3.0，蛋白胨：10.0，Na Cl：5.0，琼脂：18.0，p H：7.4～7.6。

发酵培养：250 m L三角瓶，装液量50 m L，按5%的接种量接种至发酵培养基中，37℃180 r/min的摇床培养48 h。

发酵培养基（g/L）：甘油：20.0，蛋白胨：13.0，Mg SO4：1.2，Na Cl：5.0，摇瓶装液量20 m L/100 m L（V/V），接种量5%（V/V），p H：6.5。

2．灵菌红素的提取

第一种方案：取发酵液50 m L，5 000 r/min离心15 min，去除上清液，沉淀，加入10 m L p H=4的酸性丙酮，超声波辅助提取3次，每次20 min，合并提取液用旋转蒸发器旋转40℃旋转蒸干得到丙酮粗提物，用10 m L石油醚脱脂3次，去除残余石油醚得脱脂物。

第二种方案：收集发酵液（计算体积），5 000 r/min下离心15 min，收集菌体，加入氯仿15 m L碾磨，后加水20 m L，混合离心，吸取氯仿层，随后用旋转蒸发器40℃旋转蒸干得到氯仿提取物。

3．灵菌红素的分离纯化

上述脱脂物用5 m L氯仿溶解，离心去除不溶物，上清液上硅胶柱，进行硅胶柱层析（1∶30的质量比），以氯仿∶乙酸乙酯=9∶1为洗脱剂，流速1 m L/min，TLC检测，收集灵菌红素组分（每管5 m L），合并浓缩，烘干得层析纯灵菌红素。以实验室自制的灵菌红素产品（≥98% HPLC纯）为标准，按照标准曲线的方法测定不同操作步骤中灵菌红素的纯度和回收率。另外，层析纯灵菌红素使用石油醚进行重结晶，离心，得灵菌红素纯品。进行HPLC测定、熔点测定、NMR测定来初步鉴定其纯度。

4．计算

计算整个提取分离过程中灵菌红素的提取率和纯度变化情况。

六、实验说明

本实验属于创新性实验，可以形成创新小组，以实验操作与步骤的内容为参照组，自主设计不同的提取分离因素，考察不同的因素水平，评价自主设计实验与参照组实验的优缺点。

七、思考题

1．如何鉴定一个化合物的纯度？

2．未知化合物如何确定其结构？简要说明鉴定过程。