纤维素酶的分离纯化

任务5　纤维素酶的分离纯化

纤维素酶来源广泛、组分复杂，各组分的相对分子质量和等电点相差很小，分离纯化工作比较困难；而纤维素酶的分离纯化工作非常重要，只有得到纯酶才能了解其组成、性质及相互关系，并可根据纤维素酶的不同理化性质及纤维材料的作用特点，开展纤维素降解机制的研究，为纤维素酶分子结构研究、酶基因克隆、新酶分子的构建和DNA体外定点诱变等提供依据。下面介绍纤维素酶分离纯化的一般流程。

一、粗酶液制备

固态发酵：用一定量水浸泡固态发酵基质，后压滤得到液体酶制剂，再在4℃条件下离心，取上清液，即为粗酶液，测定粗酶液中纤维素的酶活力和蛋白质含量。

液态深层发酵：取发酵液于4℃，8000r／min，离心15min，收集上清液即为粗酶液，测定粗酶液中纤维素的酶活力和蛋白质含量。

二、粗酶液硫酸铵分级沉淀

准确取一定体积的粗酶液，在冰水浴（0℃）和磁力搅拌器匀速搅拌条件下，缓慢添加经干燥和研磨的硫酸铵粉末至粗酶液中，使酶液中硫酸铵的饱和度分别达10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%，在冰水浴中缓慢搅拌充分混合30min后，离心收集沉淀用一定量缓冲液溶解后，按照DNS法测定纤维素酶活力以及沉淀中的蛋白质总量，以此来确定去除杂蛋白所需的饱和硫酸铵的浓度。同时也可用少量上清液测定酶活力及蛋白质总量。

准确取一定体积的上清液，重复以上操作至45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%和90%硫酸铵饱和度（假设去除杂蛋白的饱和硫酸铵浓度为30%），在冰水浴中缓慢搅拌，搅拌过程中应尽量避免泛起白色泡沫，30min后，4℃、10000r／min条件下离心10min，取少量上清液测定酶活力和蛋白质浓度；收集沉淀，加入少量缓冲液溶解，再分别测定纤维素酶酶活力和蛋白质含量，然后根据下面的公式分别计算出不同硫酸铵浓度所得的比活力、纯化倍数和回收率（得率）。

比活力＝活力蛋白数／蛋白质含量（毫克）

纯化倍数＝每步的比活力／粗酶液的比活力

得率＝每步的总活力／粗酶液的总活力

由此，可得最佳的沉淀纤维素酶的饱和硫酸铵的浓度。

三、透析除盐

1．透析袋预处理

商品透析袋（截流量根据纤维素酶的相对分子质量确定）常常涂甘油以防破裂，并含有微量的硫化物、重金属和一些杂环类物质。它们容易引起蛋白质变性，因此用前需除去。其方法如下。

①将透析管剪成适当长度（10～20cm）的小段，即形成透析袋。

②在大体积的2%的碳酸氢钠和1mmol／L EDTA（pH8．0）中将透析袋煮沸10min。

③将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。

④将透析袋置于1mmol／L EDTA（pH8．0）中煮沸10min。

⑤待透析袋冷却，存放于4℃，应确保透析袋始终浸没在液体中。

⑥在使用之前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗。

2．透析法除去硫酸铵

将已处理好的透析袋用细线扎紧底端，然后将用最佳饱和硫酸铵浓度沉淀的粗酶液从管口倒入袋内，注意不能装满，留一半左右的空间，以防膜外溶剂大量进入袋内将袋胀破，或因透析袋膨胀引起膜孔径大小的改变。装入粗酶液后，扎紧袋口，悬浮于装有大量pH为8．0的Tris－HCl缓冲液中，盛缓冲液的烧杯置于磁力搅拌器上，4℃透析24h。注意勤换缓冲液，一般3～4次即可收集透析液。

四、分子筛柱层析

选择不同的葡聚糖凝胶（常见的有SephadexG－100、SephadexG－75、SephadexG－50，可根据具体情况各做一次，比较优劣），充分溶胀，抽气，分别装柱。不同的层析柱体积不同，因此所需的凝胶量也不相同，需要根据柱体积以及所选的凝胶的溶胀度进行计算，然后用一定浓度和pH的磷酸缓冲液充分平衡后上样，选择合适的流速、检验器灵敏度，测定出现吸收峰时各管的纤维素酶活力及蛋白质含量。

具体的凝胶的预处理、装柱、平衡、上样、洗脱及收集方法，以及各个过程的注意事项可参考相应的说明书及相关参考书完成，此处不再赘述。

五、SDS－PAGE凝胶电泳

采用SDS－PAGE凝胶电泳鉴定所分离的蛋白质的纯度，并对其相对分子质量进行测定。

一般多使用垂直板式不连续系统电泳，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%，利用相应的标准蛋白相对分子质量标准品，电泳后用0．25%的考马斯亮蓝R－250酸性乙醇水染色，先后用高倍与低倍甲醇脱色液充分脱色。用直尺分别量出标准蛋白、待测蛋白质区带距分离胶顶端的距离，根据标准蛋白marker的迁移率所作的回归方程，确定目标蛋白的相对分子质量。

再根据蛋白在凝胶上的条带的多少以及粗细来确定所分离蛋白的纤维素酶的纯度。