纤维素酶的活性测定

任务2　纤维素酶的活性测定

纤维素酶产生菌的初筛主要以菌株在筛选培养基上产生的透明圈的有无和大小为指标，但具体到筛选优良和高产菌株，并对菌株产纤维素酶的能力进行定量，需要采用DNS法对纤维素酶进行活性测定。

一、标准曲线的绘制

原理：DNS（3，5－二硝基水杨酸）在碱性条件下，与还原糖一起经沸水浴后可生成棕红色的氨基化合物，因还原糖含量的不同其生成物的量也有差异，导致颜色深浅不一，可通过其在550nm处的吸光度来判断生成物的量，进一步可换算成溶液中还原糖的量。

方法：取8支试管，分别加入0．0mL、0．2mL、0．4mL、0．6mL、0．8mL、1．0mL、1．2 mL、1．4mL浓度为1mg／mL的葡萄糖标准溶液，均补水至2mL，再加入3．0mL DNS试剂混合均匀，沸水浴中加热5min，取出用流动水冷却后自然冷却至室温，稀释一定倍数后于550nm波长处测定OD值（表6－1），以OD₅₅₀值为横坐标，葡萄糖含量（mg）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线并计算回归方程。

表6－1　葡萄糖标准曲线OD值测定结果

二、活性测定

取待测菌株的液体产酶发酵液，于5000r／min条件下离心20min，上清液即为粗酶液。

1．内切纤维素酶（EG）的测定

取适当稀释的粗酶液0．5mL于试管中，再加入0．5%羧甲基纤维素钠（CMC－Na）的柠檬酸缓冲液（pH5．0，0．05mol／L）1．5mL，50℃恒温水浴30min后，按DNS法测定还原糖含量，对照标准曲线计算酶活力，以高温灭活的粗酶液作为对照。在上述实验条件下，每30min产生1．0μg还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U／mL）。

2．外切纤维素酶（CBH）的测定

取适当稀释的粗酶液0．5mL于试管中，加入50mg脱脂棉，再加入1．5mL柠檬酸缓冲液（pH5．0，0．05mol／L），50℃水浴保温24h后按DNS法测定还原糖，对照标准曲线计算酶活力，以高温灭活的粗酶液作为对照。在上述实验条件下，每24h产生1．0μg还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U／mL）。

3．滤纸酶活力（FPase）的测定

取适当稀释的粗酶液0．5mL于试管中，加入1．5mL柠檬酸缓冲液（pH4．5，0．05 mol／L），再加入滤纸条50mg，50℃水浴保温1h后取出，按DNS法测定还原糖，对照标准曲线计算酶活力，以高温灭活的粗酶液作为对照。在上述实验条件下，每1h产生1．0μg还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U／mL）。

三、说明

目前，测定纤维素酶活力的方法基本采用DNS法，但是不同文献的具体测定过程有一定的差异，对酶活力的定义也有所不同，具体可参考相关文献。