实验四异构酶活性的测定

实验四　异构酶活性的测定
——以葡萄糖异构酶为例

异构酶(isomerase)亦称异构化酶，是催化生成异构体反应的酶之总称。根据异构酶的反应方式可以将其分为以下几类:①催化结合于同一碳原子的基团的立体构型发生转位反应，如UDP葡萄糖差向异构酶(生成半乳糖);②催化顺反异构的异构酶;③催化分子内的氧化还原反应(酮糖-醛糖相互转化等)，如葡萄糖磷酸异构酶(生成磷酸果糖);④催化分子内基团的转移反应，如磷酸甘油酸变位酶;⑤催化分子内脱去加成反应的异构酶。

葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化为果糖。果糖是葡萄糖的异构物，它的甜度比葡萄糖高。利用葡萄糖异构酶在60℃下可以把葡萄糖约50%转化为果糖，所得的混合物称果葡糖浆，甜度增加，食后不易发胖。在国外，把葡萄糖异构化制果葡糖浆已形成很大的产业。

【实验目的】

1．掌握葡萄糖异构酶活性测定的方法和原理。

2．掌握半胱氨酸和咔唑法测定果糖的原理的操作方法。

【实验原理】

葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化为果糖。利用半胱氨酸-咔唑法测定反应生成的果糖量。葡萄糖异构酶的酶单位规定:酶在一定反应条件下，每小时生成1 mg果糖的酶量规定为1个单位，以GIU表示。将其除以10．8即为国际单位，此时以1GIU表示。

半胱氨酸-咔唑法测定果糖的原理:单糖与强酸反应生成糠醛或其衍生物，再与显色剂半胱氨酸及咔唑缩合成有色络合物，此络合物在560 nm处有最大吸收，可以比色测定。本法是微量法，适用于葡萄糖和果糖共存时果糖的测定。显色剂半胱氨酸和咔唑可与所有糖类反应，但果糖发色程度远远超过葡萄糖，即使葡萄糖含量高于果糖1倍，对测定结果影响也不大，因蔗糖在此测定条件下会水解，增加果糖含量，故此法不能用于有蔗糖共存的样品测定。

【实验材料】

链霉菌产生的葡萄糖异构酶(固定化酶)。

【实验器材】

可见光分光光度计、水浴锅等。

【药品试剂】

1．0．2 mol/L TES-NaOHpH8．0:称取N-Tris(羟甲基)-甲基-2-氨甲基酸9．2 g溶于100 ml水中，用1 mol/L NaOH调节pH值至8．0，用蒸馏水定容到200 ml。

2．3 mol/L D-葡萄糖:称取葡萄糖54 g，加蒸馏水使其溶解，并定容到100 ml。

3．3 mmol/L CoCl₂:称取0．0843 g硫酸钴(CoSO₄·7H₂O)，加水溶解，并定容到100 ml。

4．1．5%半胱氨酸盐酸溶液:称取纯半胱氨酸盐酸盐0．375 g，用水溶解，并定容到25 ml。

5．0．12%咔唑酒精溶液:称取咔唑30 mg，用无水酒精溶解并定容到25 ml，放置在棕色瓶中，24小时后使用。

6．70%硫酸:量取分析纯浓硫酸450 ml，在不断搅拌下徐徐倒入190 ml蒸馏水中。

7．标准果糖溶液:称取预先在55℃真空干燥至恒重的分析纯果糖125 mg，用蒸馏水定容到25ml，此时果糖浓度为5 mg/ml，存放于冰箱中备用。使用时稀释100倍(浓度50μg/ml)。

8．0．3 mol/L磷酸缓冲溶液(pH7．0):称取107．4 g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)，加蒸馏水溶解并定容到1 L(A液);称取46．3 g磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)，加蒸馏水溶解，并定容到1 L(B液)。各取一定量A、B液混合，用pH计校正pH值至7．0。

9．0．03 mol/L硫酸镁:称取0．739 g硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，加水溶解并定容到100 ml。

10．0．5 mol/L高氯酸:取21 ml高氯酸(HClO₄)，用蒸馏水定容到500 ml。

【实验方法】

1．半胱氨酸-咔唑法制备果糖标准曲线:试管中分别加50μg/ml的果糖标准溶液0、0．2、0．4、0．6、0．8 ml，用蒸馏水分别补充体积至1 ml，然后每支试管中加入0．2 ml 1．5%半胱氨酸盐酸盐溶液和6 ml 70%硫酸溶液，摇匀后，立即加入0．2 ml 0．12%咔唑酒精溶液，摇匀，于60℃水浴中保温10分钟，取出用水冷却呈红紫色。在560 nm波长下比色，以吸光度对果糖浓度作图，即得果糖标准浓度曲线。

2．葡萄糖异构酶催化反应:称取合适量的固定化酶颗粒，用0．02 mol/L磷酸缓冲液(pH7．5)1 ml在3～7℃浸泡16小时，再加入上述磷酸缓冲液1．5 ml，0．03 mol/L硫酸镁溶液0．5 ml，3 mol/L D-葡萄糖溶液1．5 ml，再加蒸馏水调整至总体积5 ml，70℃反应1小时，最后加入0．5 mol/L高氯酸溶液5 ml终止反应，然后利用半胱氨酸-咔唑法测定反应生成的果糖含量。

3．半胱氨酸-咔唑法测定葡萄糖异构酶反应中果糖的产量:将上述反应终止溶液进行适当倍数的稀释(使其中果糖含量在10～40μg范围内)，准确吸取1 ml，加入0．2 ml 1．5%半胱氨酸盐酸盐溶液和6 ml 70%硫酸溶液，摇匀后，立即加0．2 ml 0．12%咔唑酒精溶液，摇匀，于60℃水浴中保温10分钟，取出用水冷却呈红紫色。在560 nm波长下比色，根据获得的吸光度在果糖标准浓度曲线图上查得相应的果糖浓度，并计算最后的果糖含量。

【思考题】

1．简单叙述半胱氨酸-咔唑法测定果糖含量的原理。

2．葡萄糖异构酶在工业上有哪些应用前景?