纤维素酶的固态发酵生产

技能训练1　纤维素酶的固态发酵生产

一、能力目标

①在了解纤维素酶固态发酵的基本原理和纤维素酶固态发酵的特性基础上，参考相关材料，能描绘出纤维素酶的发酵流程。

②能独立操作完成纤维素酶固态发酵的技术过程。

③理解并会应用纤维素酶活力的测定方法。

二、生产工艺流程

固态发酵生产纤维素酶工艺流程如图6－6所示。

图6－6　固态发酵生产纤维素酶工艺流程

三、实训材料

1．菌种

将青霉原菌种移接到10%麸皮浸汁斜面上。

2．材料

汽爆小麦麦草（汽爆条件：罐压为1．523MPa，维持压力时间为4．51min）。

固态产酶培养基：汽爆麦与麸皮的质量比为8∶2，固态比为1∶2．5，（NH₄）₂SO₄ 1．5%，MgSO₄0．6%，KH₂PO₄0．3%，pH自然，加水为2．5倍原料重，以拌好后用手捏成团但又挤不出水滴为宜。配制时先计算各种原料的质量并称重，用少量水将无机盐类溶化，再将麸皮和汽爆麦混合均匀，倒入盐溶液，搅匀后于121℃下灭菌30min，可以此作为种子培养基和发酵培养基用。

3．器材

离心机，分光光度计，恒温培养箱，250mL三角瓶，发酵罐等。

4．试剂

0．2mol／L的乙酸缓冲液，DNS试剂。

四、操作要点

1．斜面培养

将青霉接种至麸皮斜面培养基上，30℃培养3d。

2．斜面孢子液／种子的制备

吸取5mL蒸馏水于斜面试管中，用接种环刮洗孢子，孢子浓度为5．2×10⁸个／mL。也可将培养好的斜面培养基上的菌种挑取一块，接入种子培养基中，拌匀，在28～30℃的恒温培养箱中培养72h，取出于40℃下干燥后备用。

3．固态发酵

（1）三角瓶固态发酵

在250mL三角瓶中装入10g固态产酶培养基（风干料，含水量为7．5%），加水，搅匀，塞上棉塞，15kPa、20min灭菌，接种5mL斜面孢子悬浮液，搅匀，32℃培养箱培养7d。

（2）固态发酵罐发酵

在由不锈钢网做成的浅盘（30．0cm×30．0cm×9．0cm）中装约1．5kg固态培养基（以干料计），灭菌，待冷却至30℃左右时，接孢子悬浮液或将在三角瓶中培养的种子培养菌拌入，接种量为0．2%～0．3%，混匀。培养基应装得均匀疏松，防止干燥或吹风时龟裂引起空气短路。在一定温度（30～50℃）和湿度下于培养室中培养，整个过程中要合理使用室内循环和新鲜风的比例，尽量加大室内的相对湿度（90%～100%），菌体发酵过程中呼吸产热，品温升高，当超过规定温度时，必须通入空气散热，这样间歇断续通风直到结束。培养时间为3d或4d。发酵结束后，物料打碎晾干。

4．分离纯化

（1）压滤离心

将打碎晾干后的麸曲粉碎，在28～30℃下用3倍水量浸泡2～3h，再用螺旋压榨机压滤，滤液即为酶液，重复上述过程反复浸麸曲，压滤获得浓度较大的酶液，将pH调至3．0左右，静止0．5h后用冷冻离心机以4000r／min的速度离心，去除杂质，留上清液为酶液，将酶液调pH为5，用DNS法测其活力。

（2）沉淀干燥

将乙醇与酶清液低温冷却至5～7℃，用酶液一半体积的60%乙醇倒入乙醇酶液中，边倒边搅动，速度不宜太快，以免造成局部浓度过高而引起酶失活，再用95%乙醇洗涤2～3次，沉淀完全后用低温离心机离心，分离沉淀，将全部沉淀低温干燥（≤25℃）后粉碎，即得纤维素酶粉剂，用DNS法测其活力。

五、成品活性检验

取压滤离心后的溶液或将纤维素酶粉剂用一定量的0．2mol／L乙酸缓冲液溶解后，用DNS法测其各组成成分的活性。

（1）脱脂棉酶活力（C₁）测定

（50±1）mg脱脂棉加入1．5mL、0．2mol／L乙酸缓冲液和0．5mL的适当稀释的酶液，混匀，在5℃保温24h。反应后，加入1mL DNS试剂，沸水浴煮沸5min，冷却，定容至25mL，摇匀后于550nm下比色测定OD值。将每分钟产生1μmol葡萄糖的酶量作为一个酶活力单位［U／（min，g）或U／（min，mL）］。

DNS（二硝基水杨酸试剂）的配制：称取酒石酸钾钠91g溶于500mL水中，于溶液中依次加入3，5－二硝基水杨酸3．15g、NaOH 20g，加热搅拌使之溶解，再加入重蒸酚2．5 g、无水亚硫酸钠2．5g，搅拌使之冷却，冷却后定容至1L，储于棕色瓶中，放置一周后使用。

（2）滤纸酶活力（FPAU）测定

（50±1）mg的滤纸条加入上述溶液后，50℃保温60min（其他操作同脱脂棉酶活力测定）。

（3）β－葡萄糖苷酶活力（β－Gase）测定

以1%水杨素（用pH4．8、0．2mol／L乙酸缓冲液配制）作底物，保温30min（其他操作同脱脂棉酶活力测定）。

（4）羧甲基纤维素酶活力（CMCase）测定

用1%羧甲基纤维素（用pH4．8、0．2mol／L乙酸缓冲液配制）作底物，保温30min（其他操作同脱脂棉酶活力测定）。

六、实训报告

①计算纤维素酶活力。

②讨论固态发酵法生产纤维素酶的关键技术和注意事项。

七、实训思考题

1．DNS法测定纤维素酶活力的原理是什么？

2．三角瓶发酵和发酵罐发酵的区别是什么？