任务种子制备一相关知识发酵生产中

任务3　种子制备

一、相关知识

发酵生产中，要求菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐接种量的要求；无杂菌污染，适应性强，能保持稳定的生产能力。所以在发酵前，需要对保藏的菌种进行活化，而后进行摇瓶扩大培养，完成实验室种子制备。再用一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；生产车间的种子制备好后转种至发酵罐进行发酵。由于条件限制，本实验只进行到摇瓶种子制备。

二、实训器材

1．材料

鉴定的高产柠檬酸黑曲霉菌株。

2．器材及其他用品

微生物实验常用器材，载玻片，显微镜，直尺，恒温振荡培养器等。

3．试剂

硫酸铵，1mol／L氢氧化钠溶液，1mol／L盐酸，蔗糖，琼脂，75%乙醇，马铃薯，玉米粉，纯净水。

三、实训步骤

1．无菌PDA培养基的配制

根据参加实验的人数、操作水平及实验室器材进行计算，确定配制培养基的体积。固体培养基用于活化菌种，液体培养基用于制作糖化酶。配制方法同任务2黑曲霉的鉴定中PDA培养基的配制方法，液体培养基不加琼脂。

2．种子活化

取冰箱保存的黑曲霉斜面菌种一支，用接种环挑取一环转接于PDA培养基斜面上，于35℃培养箱中培养3～5天，待长满大量黑色孢子后即为活化的斜面种子。

3．糖化酶制备（或者直接购买液化酶和糖化酶）

取冰箱保存的黑曲霉斜面菌种一支，加入无菌水，用接种环将菌苔从培养基上刮下转接于液体PDA培养基，于35℃培养箱中培养2～3天，以少见培养基转黑为好。

4．实验室种子培养基制备

称取玉米粉100g、硫酸铵5g，加水至1000mL，加5%黑曲霉PDA培养液（或者用购买的液化酶和糖化酶）进行糖化1～2天，分装于锥形瓶中，锥形瓶内装液量为20%。分装后于121℃灭菌30min。

5．实验室种子培养

将1～2环活化的斜面菌种接入已糖化的实验室种子培养基中，于恒温振荡器中（35±1）℃、250r／min条件下培养24～36h。

6．镜检

取培养液稀释，在显微镜下计数，计算出黑曲霉菌丝球浓度，一般达6．0×10⁵～1．0×10⁶个／mL菌球。合格的菌丝球应是致密的，菌球直径不超过0．1μm，菌丝短且粗，分支少，瘤状，部分膨胀。孢子数量达到10⁸个／g，即可用作柠檬酸发酵的液体种子。

7．种子罐培养基制作及种子罐培养（有条件的选作）

种子罐培养是实验室种子的进一步扩大，其培养基接近于发酵培养基，其组成为玉米粉8%～14%，麸皮1%（或加0．15%硫酸铵）。灭菌后用培养好的实验室种子接种，在35℃下通气培养24～36h，pH降至3以下。镜检无杂菌，菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1万～2万之间，无异味，无杂菌污染，pH　2～2．5，酸度1．5%～2．0%，即可用于发酵生产。