蛋白酶的固体发酵

实训28　蛋白酶的固体发酵——蛋白酶的生产

一、实训目的

（1）了解固体发酵生产蛋白酶的方法。

（2）掌握制种相关技术。

（3）了解麸曲（大曲）的配制和灭菌技术。

二、实训原理

微生物发酵方式除液体发酵外，还有固体发酵。通常是先制成种曲，然后将种曲接种到固体培养基中，拌匀分摊在曲盘上，或堆积起来进行发酵。这种方法设备简单，投资少，但占地面积大，劳动强度大。人们所熟知的“5406”、“920”农药以及日常食用的酱油、酒精糖化曲都是固体发酵法生产的。

本实验以搪瓷盘代替木制的曲盘，用栖土曲霉3．942（Aspergillus terricola 3．942）为蛋白酶产生菌，发酵生产蛋白酶。

三、实训器材

1．培养基

（1）含麸皮察氏培养基。

（2）种曲培养基：麸皮、米糠、2．5%粗Na₂CO₃（纯碱）溶液。

（3）无菌水。

2．器皿

（1）250mL锥形瓶内装玻璃珠（约50粒），再加20mL水，灭菌后备用。（2）无菌吸管10mL　1支。

（3）大口吸管10mL（可用坏的大吸管制作）1支。

（4）曲盘：搪瓷盘（代用）。

3．其他

纱布，温度计等。

四、实训步骤

1．种子制备

1）“一级种子”（大斜面菌种）的制备

用接种环挑取砂土管保藏的菌种或在冰箱中保藏的斜面菌种，接种于含麸皮察氏斜面培养基上，放于28℃恒温箱中培养5天，待长成大量咖啡色孢子后即成为“一级种子”（图3－30）。

图3－30　“一级种子”的制备

2）“二级种子”（锥形瓶菌种）的制备

（1）浓孢子悬液的制备：称麸皮8g、米糠2g放入500mL锥形瓶中，做2瓶。然后各均匀地滴加2．5%的粗Na₂CO₃溶液10mL，摇匀，加通气式纱布棉塞，放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20min。

在大斜面菌种管中加入10mL无菌水，用接种环不断搅拌即成浓孢子悬液。

（2）稀孢子悬液的制备：将一个斜面的浓孢子悬液倒入装有20mL无菌水（内装玻璃珠）的250mL锥形瓶中，摇荡5min，使栖土曲霉分生孢子均匀分散开，即成稀孢子悬液。

（3）种曲培养基的接种：用10mL的大口吸管，吸取稀孢子悬液1mL于种曲培养基中，然后摊开“通气式”纱布棉塞，扎好，并在掌心中轻轻拍瓶子，使孢子与培养基充分混匀。28℃培养1天后，再次拍匀瓶内培养物，培养4天后即成“二级种子”（种曲）（图3－31）。

图3－31　“二级种子”的制备

2．麸曲（大曲）的配制和灭菌

（1）麸曲的配制：麸皮160g，米糠40g，纯碱5g，水200mL，按比例混匀，用牛皮纸包扎好，放在高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌30min。

（2）搪瓷盘的清洗和消毒：用肥皂水将搪瓷盘洗刷干净，再用清水冲洗，洗完后盘口向下，晾干备用。

3．接种与摊盘

（1）接种前用肥皂洗手。

（2）将灭菌过的麸曲倒在搪瓷盘上，冷却至30℃左右，再均匀地拌入1%种曲，随后摊放在搪瓷盘上，厚度约1～2cm。

4．培养

摊盘后，放到预先消过毒的曲室中。室内温度为28℃，相对湿度接近100%，冬天可用蒸汽进行加温，保湿。培养3天，培养过程中注意不使品温超过34℃。如品温过高，除降低室温外，还可进行翻盘。如曲层温度过低，盘上可盖一层无菌湿纱布。

5．观察

按表3－15中的项目进行观察记录。

表3－15　发酵产生蛋白酶观察记录

6．蛋白酶的提取与测定

略。

7．注意事项

（1）保证种曲不染杂菌。

（2）曲室温度、湿度要控制适宜。

五、思考题

（1）用搪瓷盘代替曲盘有何优点？

（2）接种量大小对固体曲发酵的影响如何？

（3）曲层的厚薄对固体曲发酵的影响如何？

（4）如何判断曲的质量好坏？