实训蛋白酶的固体发酵

时间：2022-02-12 理论教育版权反馈

【摘要】：实训29　蛋白酶的固体发酵——孢子数和酶活力的测定一、实训目的学习用固态米曲霉制蛋白酶的方法。了解不同条件对米曲霉产孢子数和蛋白酶活力的影响。利用蛋白酶催化酪蛋白在三氯乙酸可溶物中紫外线光密度的变化，可测定酶活力的高低。在以上优化条件下制曲，采用不同浓度的氯化钠浸提蛋白酶，考查不同浓度的氯化钠对酶活力的影响。

实训蛋白酶的固体发酵_孢子数和酶活力_微生物实验实训

实训29　蛋白酶的固体发酵——孢子数和酶活力的测定

一、实训目的

（1）学习用固态米曲霉制蛋白酶的方法。

（2）掌握孢子测定的方法。

（3）掌握蛋白酶活力测定的方法。

（4）了解不同条件对米曲霉产孢子数和蛋白酶活力的影响。

二、实训原理

蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶主要由霉菌、细菌生产，其次是酵母、放线菌。本实训中，采用米曲霉发酵生产蛋白酶。

固态发酵是指在没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物发酵的一个生物反应过程。

米曲霉发酵能产生蛋白酶、淀粉酶、脂酶等多种酶，其广泛用于酱油、酱类产品的制作，可形成酱油和酱类物质独特的色、香、味、体。将纯种的米曲霉接种在麸皮培养基上，保持适宜的条件，米曲霉以麸皮培养基中的糖和氨基酸为养分生长繁殖，并分泌各种酶。

蛋白酶活力测定原理：蛋白质或多肽水解后生成的含苯环氨基酸对275nm波长的紫外光具有最大的吸收值。利用蛋白酶催化酪蛋白在三氯乙酸可溶物中紫外线光密度的变化，可测定酶活力的高低。

三、实训器材

1．材料

麸皮，面粉，豆饼粉，米曲霉菌种，95%乙醇，稀硫酸（1∶10），2%酪蛋白，4%三氯乙酸，氯化钠等。

2．仪器

固态培养箱，显微镜，血球计数板，分光光度计。

四、实训步骤

麸皮和面粉等按1∶5比例加水混匀后，放入高压蒸汽灭菌锅内121℃蒸煮30min，冷却至40℃后接入米曲霉菌种，在一定温度下培养，观察和记录米曲霉生长的典型现象，在培养48h后测定其孢子数，再培养72h后测定其蛋白酶活力。

1．孢子数的测定方法

1）样品稀释

精确称取种曲1g（称准至0．002g），倒入盛有玻璃珠的250mL锥形瓶内，加入95%乙醇5mL、无菌水20mL、稀硫酸（1∶10）10mL，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，使滤渣不含孢子，最后稀释至500mL。

2）制计数板

取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静置5min，待孢子沉降。

3）观察计数

用显微镜的低倍镜和高倍镜观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因此计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不留遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。

使用16×25型计数板时，只计板上四个角上的4个中格（即100个小格），如果使用25×16规格的计数板时，除计四个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即80个小格）。每个样品重复观察计数不少于2次，然后取其平均值。

4）计算

（1）16×25型计数板。

式中：N——100小格内孢子总数（个）；

V——孢子稀释液体积（mL）；

G——样品质量（g）。

（2）25×16型计数板。

式中：N——80小格内孢子总数（个）；

V——孢子稀释液体积（mL）；

G——样品质量（g）。

2．酶活力的测定方法

取试管两只，每只试管加入样品稀释液1mL，置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白5mL，精确保温10min，时间到后，各管立即加入0．4mol／L三氯乙酸5mL，以终止反应。继续在水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心分离或过滤。取滤液用分光光度计在275nm处测定其吸光度。

空白实验2测定方法同上，在加酪蛋白之前可先加0．4mol／L三氯乙酸5mL，使酶失活。

计算：在40℃下蛋白酶1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。