实验一水解酶活性的测定

实验一　水解酶活性的测定>
——以淀粉酶为例

【实验目的】

掌握淀粉酶活性测定的原理和操作方法。

【实验原理】

淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。水稻萌发时淀粉酶活性最强，此时淀粉酶活性的大小与种子萌发力有关。

淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成橙红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。

植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化:而α-淀粉酶不耐酸，在pH3．6以下则发生钝化。根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。

【实验材料】

萌发3～4天的水稻种子。

【实验器材】

20 ml具塞试管、移液管、100 ml容量瓶、研钵、721型分光光度计、离心机、恒温水箱、离心管等。

【药品试剂】

1．石英沙。

2．1%淀粉溶液:称1 g可溶性淀粉，加入100 ml蒸馏水煮沸(临用时配制)。

3．pH5．6柠檬酸缓冲液:A．称取柠檬酸21g，溶解后定容到1000 ml;B．称取柠檬酸钠29．4 g，溶解后定容到1000 ml;量取A液55 ml与B液145 ml混匀，即为pH5．6的缓冲液。

4．0．4 mol/L氢氧化钠溶液。

5．3，5-二硝基水杨酸试剂:取1 g 3，5-二硝基水杨酸，溶于20 ml 2 mol/L氢氧化钠中，加入50 ml蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100 ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。

6．麦芽糖标准溶液:称取0．1 g麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容到100 ml，取为1 mg/ml麦芽糖标准液。

【实验方法】

1．酶液的制备:称取去根萌发水稻种子2 g(含外壳)，置研钵中，加0．5 g石英沙研磨成匀浆。用8 ml蒸馏水分次洗涤研钵，将匀浆转入离心管中，搅拌均匀后放置15～20分钟(间隔搅拌2～3次)。3500 r/min离心10分钟，将上清液转入25 ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，得粗酶液。

2．α-淀粉酶与β-淀粉酶的酶促反应:取4支10 ml具塞刻度试管，编号，按表4-1加入各液。各管混匀后，置40℃水浴准确保温5分钟，取出后立即向3、4号试管中分别加入4 ml 0．4 mol/L NaOH终止酶活性。

表4-1　　　　　　　α-淀粉酶与β-淀粉酶的酶促反应

3．麦芽糖的测定:

(1)标准曲线制作:取20 ml刻度试管7支，编号，分别加入1 mg/ml麦芽糖标准液0、0．2、0．6、1、1．4、1．8和2 ml，然后各管加蒸馏水，使体积均达2 ml，再向各管加3，5-二硝基水杨酸试剂2 ml，置沸水浴中煮沸5分钟，取出后在自来水里冷却，用蒸馏水稀释至20 ml，摇匀后在520 nm波长下用分光光度计比色，以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。

(2)样品的测定:取以上酶作用后的反应液及对照管中的溶液各2 ml，分别放入20 ml具塞刻度试管中，加入2 ml 3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至20 ml，摇匀后在520 nm波长下用分光光度计比色，记录OD值，从麦芽糖曲线中查出相应麦芽糖含量，进行结果计算。

4．结果计算:

式中:

A为酶反应管中麦芽糖含量，即3号和4号管中麦芽糖毫克数的平均值。

A'为对照管中麦芽糖含量，即1号和2号管中麦芽糖毫克数的平均值。

【注意事项】

1．实验前应将所用研钵、试管、容量瓶等玻璃器皿冲洗干净，并注意移液管分别使用，以避免酶遇强碱失活。

2．注意控制好酶反应温度及pH值。

【思考题】

1．简述淀粉酶活性测定的原理。

2．测定植物种子萌发过程中淀粉酶活性的变化有何意义?