血清酶活力测定

血清酶活力测定_生物化学实验技术

实验项目十二　血清酶活力测定

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述血清酶活力测定的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述血清酶活力测定实验操作要点。

（3）能够准确鉴别血清酶活力检测结果，并能说明其临床意义。

【能力目标】

（1）能够正确完成血清酶活力测定各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够正确分析血清中相关酶活性升高所代表的意义。

案例引导

患者，男，42岁，一周前食用海鲜后，出现低热、全身疲乏无力、食欲减退，并伴有恶心、呕吐、厌油腻、肝区不适及尿黄等症状，休息后不见好转。肝功能化验结果显示血清丙氨酸氨基转移酶浓度为751.28U/L，总胆汁酸浓度为101.35μmol/L，胆碱酯酶浓度为368.52U/L。请结合症状及检验结果给出初步诊断。

（提示：急性肝炎）

一、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定

【实验原理】

上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶的活性呈正比，在340nm处NADH呈特征性吸收峰，而NAD^＋没有。根据340nm处吸光度下降速率（ΔA/min）计算ALT的活性单位。

【实验器材】

试管，分光光度计或半自动生化分析仪，微量加样器，恒温水浴箱。

【药品及试剂】

（1）新鲜血清。

（2）商品试剂盒主要成分及浓度。

试剂R₁：α－酮戊二酸（15mmol/L）、NADH（0.18mmol/L）、乳酸脱氢酶LDH（不低于5000U/L）。

试剂R₂：Tris缓冲液pH值为7.3（100mmol/L）、L－丙氨酸（500mmol/L）。

【试剂配制】

取一定量R₂（参看R₁瓶签）复溶1瓶R₁，溶解后即为工作液。

操作流程

【操作步骤】

1.工作液配制

工作液按照相应试剂盒说明进行配制。

2.设置反应体系

取试管2支，分别标记，按表3－26血清丙氨酸氨基转移酶活性测定反应操作步骤向各管加入相应试剂。

表3－26　血清丙氨酸氨基转移酶活性测定反应操作步骤（单位：mL）

分别混匀，置于37℃恒温水浴箱中，保温1min（避免阳光直射）。

3.比色测定

设置半自动生化分析仪（或分光光度计）波长为340nm，以空白管调零，进行测定。

【实验数据处理及结果分析】

【实验意义】

正常值参考范围：37℃时，男性ALT为不高于40U/L，女性ALT为不高于31 U/L。

ALT在人体体内以肝脏含量最为丰富，其他组织（如心肌等组织）中此酶含量也不少。所以在肝炎急性期，药物中毒性肝细胞坏死时ALT明显升高，肝癌、肝硬化、慢性肝炎、心肌梗死时ALT中度升高，阻塞性黄疸、胆管炎时ALT可轻度升高。

二、血清乳酸脱氢酶活性测定

【实验原理】

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH，又称为L－乳酸：NAD^＋氧化还原酶）广泛存在于生物细胞体内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中测定LDH含量的方法很多，其中，紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH、NAD^＋在340nm处及260nm处有各自的最大吸收峰，因此以NAD^＋为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得到改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，其基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下加入一定量酶液，并观察NADH在反应过程中340nm处光的吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义如下：在25℃、pH值为7.5条件下A_340nm每分钟下降1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（单位：U/mg）。

利用上述原理，改变不同底物则可测定相应脱氢酶反应过程中A_340nm的变化，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶等，适用范围很广。

【实验器材】

组织捣碎机，紫外分光光度计，恒温水浴箱，移液管（5mL、0.1mL），微量注射器（10μL）。

【药品及试剂】

磷酸氢二钾、磷酸二氢钾。

【试剂配制】

50mmol/L、pH＝6.5的磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液。

溶液A 50mmol/L K₂HPO₄：称取K₂HPO₄1.74g加入蒸馏水溶解后定容至200mL。

溶液B 50mmol/L KH2PO₄：称取KH2PO₄3.40g加入蒸馏水溶解后定容至500mL。

取溶液A 31.5mL与溶液B 68.5mL，调节混合pH值至6.5。置于4℃冰箱内备用。

10mmol/L、pH＝6.5的磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液可用上述母液稀释得到。现用现配。

0.1mol/L、pH＝7.5的磷酸盐缓冲液可用上述母液稀释得到。现用现配。

NADH溶液：称取3.5mg纯NADH置于试管中，加入0.1mol/L、pH＝7.5的磷酸缓冲液1mL摇匀。现用现配。

丙酮酸溶液：称取2.5mg丙酮酸钠，加入0.1mol/L、pH＝7.5的磷酸缓冲液29 mL，使其完全溶解。试剂现用现配。

操作流程

【操作步骤】

1.制备肌肉匀浆

称取20g兔肉，按重量体积比＝1∶4加入4℃预冷的10mmol/L、pH值为6.5的磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液中，用组织捣碎机捣碎，每次10s，连续操作3次。将匀浆液倒入烧杯中，置于4℃冰箱中提取过夜，过滤后得到组织提取液。

2.测定LDH活力

实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴箱中预热。取两只石英比色杯，在一只比色杯中加入0.1mmol/L、pH值为7.5的磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3mL，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零；另一只比色杯用于测定LDH活力，依次加入丙酮酸钠溶液2.9mL、NADH溶液0.1mL，加盖摇匀后，测定340nm处吸光度值A。取出比色杯加入经稀释的酶液10μL，立即计时，摇匀后，每隔0.5min测一次A3_40nm，连续测定3min，以A对时间t作图，取反应最初线性部分，计算A_340nm/min减少值。加入酶液的稀释度（或加入量）时应控制A_340nm/min下降值在0.1～0.2之间。

【实验数据处理及结果分析】

计算每毫升组织提取液中LDH活力单位。

LDH活力单位（U）＝（A₃₄₀/min×稀释倍数）/酶液加入量（10μL）×10^－1

提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）×总体积

【注意事项】

（1）实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，则应储存在－20℃冰箱内。

（2）酶液的稀释度及加入量应控制A_340nm/min下降值在0.1～0.2之间，以减少实验误差。

（3）NADH溶液应在临用前配制。

【实验意义】

乳酸脱氢酶是在体内能量代谢过程中的一个重要的酶。此酶几乎存在于所有组织中，以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。这些组织中的LDH的活力比血清中高得多。所以当少量组织坏死时，该酶即释放入血而使其血液中的酶的活力升高。测定此酶常用于对心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。

能力检测

一、单项选择题

1.ALT在下列哪个组织中含量最高？（　　）

A.肝脏　　B.肾脏　　C.胰腺　　D.大脑　　E.胃

2.LDH是由两种亚基组成的四聚体，共形成几种同工酶？（　　）

A.2种　　B.3种　　C.4种　　D.5种　　E.6种

3.心肌梗死时，下列哪项的活性升高？（　　）

A.LDH₁　　B.LDH₂　　C.LDH₃　　D.LDH₄E.LDH₅

4.琼脂糖电泳时，从阳极至阴极LDH同工酶区带依次为（　　）。

A.LDH₂，LDH₁，LDH₃，LDH₄，LDH₅　　B.LDH₅，LDH₁，LDH₂，LDH₃，LDH₄

C.LDH₃，LDH₁，LDH₂，LDH₄，LDH₅　　D.LDH₁，LDH₂，LDH₃，LDH₄，LDH₅

E.LDH₄，LDH₁，LDH₂，LDH₃，LDH₅