蛋白酶活力的测定

一、实验目的

掌握食品中酶活测定方法并理解其原理。

二、实验原理

蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林试剂还原，生成蓝色化合物(钼蓝和钨蓝的混合物)，可从蓝色的深浅测知活力的大小，以比色法测定。

三、实验试剂

(1)福林试剂:在2000mL磨口回流装置内加入钨酸钠100g，钼酸钠25g，水700mL，85%磷酸50mL，浓盐酸100mL，文火回流10h，待冷却后移去冷凝管，加入硫酸锂100g，水50mL和溴水数滴，摇匀。使呈黄色，再煮沸15min，以驱除残溴，冷却定容至1000mL，过滤，滤液贮存在棕色瓶中，用氢氧化钠标定，稀释至1mol/L。

(2)0．4mol/L碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3)42．4g，以蒸馏水溶解并定容至1000mL。

(3)0．4mol/L三氯乙酸溶液:称取65．4g三氯乙酸以蒸馏水溶解定容至1000mL。

(4)缓冲溶液:

①0．05mol/LpH3．0乳酸－乳酸钠缓冲液(供537酸性蛋白酶用)。

②0．02mol/LpH7．5磷酸缓冲液(供1．398中性蛋白酶用)。

③0．02mol/LpH7．2磷酸缓冲液(供放线菌166和霉菌3．942中性蛋白酶用)。

④pH11．0硼砂－氢氧化钠缓冲溶液(供2709、A－57、1213碱性蛋白酶用)。

(5)酶蛋白溶液:

①3．942中性蛋白酶用2%酪蛋白溶液。

②537酸性蛋白酶用2%酪蛋白溶液。

③166蛋白酶用0．5%酪蛋白溶液。

④1．398蛋白酶用0．5%酪蛋白溶液:正确称取酪蛋白0．5g，先用0．5mol/LNaOH少许湿润，再加入60mLpH7．5、0．02mol/L磷酸缓冲液，在沸水中完全溶解，冷却后用0．5mol/L NaOH调pH至7．5，移入容量瓶用缓冲液定容至100mL。

⑤2709蛋白酶用2%酪蛋白溶液:正确称取2g酪蛋白，先用0．5mol/LNaOH6mL湿润，再加入约80mL、pH11．0硼砂－氢氧化钠缓冲液，然后在沸水浴中加热，使之完全溶解，冷却后用0．5mol/LNaOH调节pH至11．0再移入容量瓶用缓冲液定容至100mL。

⑥标准酪氨酸溶液。

四、实验步骤

(1)标准曲线的绘制，取9支试管，按表4－1进行稀释:

表4－1　酪氨酸标准曲线设计表

(2)酪氨酸溶液制备:精确称取酶粉(或吸取发酵液1mL)，用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上层液体小心倾入容量瓶中，沉淀部分再加入少量上述缓冲液溶解，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度摇匀(必要时纱布过滤)。根据酶活力的高低，再用缓冲液稀释到一定倍数(使其光密度值在0．2～0．4范围内)。

(3)测定:取4支10mL离心管，分别加入1mL稀释酶液，其中1支为空白管，3支为平行试验管，置入40℃水浴中预热3～5min，在3支平行试管中分别加入1mL2%酪蛋白溶液(有的酶为0．5%酪蛋白)，准确计时保温10min。随后立即加入2mL0．4mol/L三氯乙酸，离心分离或用滤纸过滤，分别吸取1mL上清液，加5mL0．4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1 mL福林试剂，摇匀，于40℃水浴显色15min。

空白管中只加入2mL0．4mol/L三氯乙酸溶液，再加1mL2%酪蛋白溶液，离心分离或用滤纸过滤。以下操作与平行试验管相同。

以空白管为对照，在680nm波长下测定光密度，取其平均值。

五、结果计算

蛋白酶活力单位定义:1g酶粉或1mL酶液在一定的温度与pH条件下，每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克数。

蛋白酶活力按各种酶来计算:

3．942，537，2709酶活力单位=K×△OD×4/10×N×1/W 166、1．398酶活力单位=K×△OD×6/15×N×1/W

式中:K——标准曲线中△OD值为1°所相当的酪氨酸微克数;

△OD——平行试验管的平均光密度;

4/10——离心管中反应液总体积为4mL，反应时间为10min; 6/15——离心管中反应液总体积为6mL，反应时间为15min; N——稀释倍数;

W——酶粉(或发酵液)称重(g)或(mL)。

五、注意事项

(1)酪蛋白配制应严格按操作方法，否则影响测定数据。

(2)测定固体曲酶时，一般稀释200～500倍;酶液则要稀释500倍为宜。

(3)为统一起见，酪蛋白使用化学纯试剂。