测定细胞活力

（一）实验目的和原理

活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-苯基四氮唑[3-（4，5-dimethylthiazol-2yl）-2，5-diphenylterazoliμm bromide，MTT]为蓝紫色的不溶于水的甲臜（formazan），甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。由于甲臜的多少可通过酶标仪测定其在570nm处的吸收度（OD值）而得知，因此可根据OD值推测出活细胞的数目，了解细胞增殖的能力。

（二）实验试剂

MTT、二甲基亚砜。

（三）实验步骤（适用于贴壁细胞）

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，（0.2～1）×104个细胞/孔，细胞浓度可以调整。

2.置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，铺板24h后，用无血清培养液同步16～18h。

3.换上含血清的培养液后（200μl/孔），加入不同浓度的药物（药物要经过适当处理，如溶解性、除菌等），时间依据实验需要，观察24h、48h、72h、96h等时间点。

4.小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，离心后再次弃上清。

5.每孔加入100μl新鲜培养液，再加入10μlmTT溶液（5mg/ml，即0.5%mTT），继续培养4h。

6.终止培养，小心吸去孔内培养液。

7.每孔加入100μl二甲基亚砜（DMSO），置温箱中5～15min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm或570nm处（single3）测量各孔的吸光值。

8.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定5复孔。

（四）注意事项与常见问题

1.实验时应设置调零孔、对照孔、加药孔。调零孔加培养基、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

2.每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。

3.贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入0.5%mTT。96孔板量为20μl/孔。每100μl培养液加入10μl0.5%mTT。

4.如果不使用96孔板，培养基超过100μl，MTT按照10%的比例加入。

5.MTT一般4℃保存2周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。

6.对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm，并且建议以655nm作为参考波长。

7.96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。96孔板最外一圈孔一般不铺细胞，加入PBS或培养液即可。

（五）典型结果

见图1-50。

图1-50　MTT法检测不同时间点大鼠系膜细胞增殖能力

正义转染组：转染了NaDC3；尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）组：抑制NaDC3诱导的细胞肥大与衰老

参考文献

[1]Zhuo L,Cai G,Liu F,et al.Expression and mechanism of mammalian target of rapamycin in agerelated renal cell senescence and organ aging.Mech Ageing Dev,2009,130:700-708.

[2]Liu W,Hong Q,Bai XY,et al.High-affinity Na(+)-dependent dicarboxylate cotransporter promotes cellular senescence by inhibiting SIRT1.Mech Ageing Dev,2010,131:601-613.