淋巴细胞功能测定

三、淋巴细胞功能测定

淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是进行迟发型超敏反应，借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或丝裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞增殖试验、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定。

（一）T细胞功能测定

T细胞具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和丝裂原的应答反应以及产生细胞因子等，根据这些特点建立了一系列的检测方法，其中有些已用作临床检测细胞免疫功能的指标。

1.T细胞增殖试验　本试验又称T细胞转化试验。T细胞在体外经抗原或丝裂原刺激后可发生增殖，转变成淋巴母细胞。主要表现为细胞内蛋白质和核酸合成增加等代谢变化以及细胞变大、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、染色质疏松等形态改变。

体外引起淋巴细胞转化的刺激物种类很多，包括植物血凝系、刀豆素A、美洲商陆和脂多糖等即丝裂原，以及破伤风类毒素、链球菌激酶、纯化蛋白衍生物（PPD）和白色念珠菌等抗原性刺激物。T细胞增殖的试验方法如下：

（1）形态学检查法　将外周血液或分离的单个核细胞与适量的PHA混合，置37℃培养72 h，取培养细胞作涂片染色镜检。根据细胞的大小、核与胞浆的比例、胞浆的染色性以及有无核仁等特征（表8-1），分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和未转化的淋巴细胞，前两者为转化细胞。每份标本计数200个细胞，按下列公式计算转化率。

转化率=转化的淋巴细胞数/（转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数）×100％

在正常情况下，健康人外周血经PHA刺激的淋巴细胞转化率为60％～80％，小于50％可视为转化率降低。形态学方法简便易行，便于基层实验室推广采用，但判读结果受主观因素影响较大，有些细胞形态难以确认，因此重复性和可靠性较差。

（2）³H-TdR掺入法　T细胞接受特异性抗原或丝裂原刺激转化为淋巴母细胞的过程中，合成DNA量倍增，其转化程度与DNA的合成呈正相关。此时若在培养液中加3 H标记的DNA前体（³H胸腺嘧啶苷，³H-TdR），即被转化的淋巴细胞摄取掺入新合成的DNA中。根据掺入的多少可推测细胞增殖程度。

将全血或分离的单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，每份样品分实验管和对照管。实验管加最适量和亚适量PHA后，移至5％ CO₂温箱37℃培养72 h，每管加适量3 H-TdR，继续培养4 h后，将细胞收集在玻璃纤维膜上，洗涤处理，用液体闪烁器测量淋巴细胞内的放射性核素量，记录每分钟脉冲数（cpm），算出3个实验管的均数±S。通常以刺激指数（SI）表示转化能力。

SI=PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值

本法的敏感性高，客观性强，重复性好，可自动操作，但需要一定的设备条件，结果受放射性核素半衰期和污染的影响。

另外，MTT（溴化二甲基噻唑二苯四唑）比色法因操作简单，且无放射性同位素污染而较为常用。

表8-1　未转化和转化淋巴细胞的形态特征

2.T细胞介导的细胞毒试验　T细胞介导的细胞毒性是细胞毒性T细胞（CTL）的特性，凡致敏的T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标，特别是测定肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力，常作为判断预后和观察疗效的指标之一。该试验的原则是选用适当的靶细胞，常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株，经培养后制成单个细胞悬液，按一定比例与受检的淋巴细胞混合，共温一定时间，再观察肿瘤细胞被杀伤的情况，常用方法如下：

（1）形态学检查法　淋巴细胞与肿瘤细胞混合共育后，以瑞氏染液着色，用显微镜计数残留的肿瘤细胞数，通过计数淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的比率，判断效应细胞的杀伤活性。

抑制率％=（对照组平均残留肿瘤细胞数-实验组平均残留细胞数/对照组平均残留肿瘤细胞数）×100％

（2）¹²⁵I-UdR掺入法　以细胞毒指数表示T细胞的细胞毒活性。

3.MHC-肽四聚体技术该技术的基本原理是T细胞的抗原特异性是由TCR决定的，它通过识别APC表面的MHC-肽复合物，并在一系列共刺激分子的作用下，介导T细胞的活化，使之发挥生物学作用。四聚体技术使抗原特异性CTL活性检测达到特异、高效和直接定量的程度，可应用于免疫学研究和检测、特异性免疫治疗以及疫苗疗效监测等多方面。

知识与技能拓展

MHC-肽四聚体技术

可溶性MHC单体分子与TCR的亲和力低，解离快，而多价分子可与一个特异性T细胞上的多个TCR结合，使其解离速度大大减慢。为此John Altman等提出借助生物素-亲和素级联放大原理构建MHC-I类分子四聚体。该方法通过基因工程技术把长度为15个氨基酸残基的生物素酶底物肽加在MHC-I类分子如HLA-A₂重链的羧基端形成融合蛋白，在体外按一定比例与β₂-微球蛋白及特异的抗原短肽共孵育，使其折叠成正确的构象，成为pMHC复合物。将生物素标记在底物肽的赖氨酸残基上，使得一个标记荧光素的亲和素与四个生物素标记的pMHC复合物结合形成四聚体，MHC-抗原肽四聚体与抗原特异性CTL上的TCR结合后，即可以通过流式细胞仪定量检出体内抗原特异性CTL，并能将其分选出以供体外培养扩增和功能分析之用。

4.细胞内细胞因子检测　将待检淋巴细胞与靶细胞按比例混合，培养一定时间后，取培养物涂片，借助普通光学显微镜（HE染色）、荧光显微镜（碘化丙锭染色）或透射电镜对细胞进行形态学观察。其优点是基于单细胞水平，可以同时检测多个参数、多种因子；缺点是操作复杂，灵敏度相对较低，容易出现假阳性。

5.体内试验　正常机体对某种抗原建立了细胞免疫后，用相同抗原做皮肤试验时，常出现阳性的迟发型超敏反应。这不仅可以用来检查受试者是否对某种抗原具有特异性细胞免疫应答能力，还可以检查受试者整体的细胞免疫状态。

（1）特异性抗原皮肤试验　常用的特异性抗原皮肤试验为结核菌素皮肤试验（见第十一章第四节）。其他皮试抗原还有白色念珠菌素、皮肤毛癣菌素、腮腺炎病毒等。

（2）PHA皮肤试验　将定量的PHA注射到受试者前臂皮内，可非特异性刺激T细胞发生母细胞转化，呈现以单个核细胞浸润为主的炎性反应。一般在注射后6～12 h局部出现红斑和硬结，24～48 h达高峰。通常以硬结直径大于15 mm者为阳性反应。PHA皮肤试验敏感性较高，比较安全可靠。

（二）B细胞功能测定

B细胞功能测定主要是检查B细胞在特异性抗原刺激下分泌抗体的能力，即通过检测抗体可以直接反映B细胞的功能。由于抗体的检测技术比较成熟，因此临床上很少做B细胞功能测定，必要时多采用酶联免疫斑点技术（enzyme-linked immune spot，ELISPOT）测定B细胞产生抗体的能力。

1.B细胞增殖试验　原理与T细胞增殖试验相同，但刺激物不同，小鼠B细胞可用细菌LPS作为刺激物，人B细胞则用含SPA的金黄色葡萄球菌菌体及抗-IgM抗体等刺激。

2.溶血空斑试验　经典的溶血斑试验是用SRBC免疫小鼠，4天后取出小鼠脾细胞，加入SRBC及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇注在平皿内或载玻片上，使成一薄层，置37℃温育。结果是抗体生成细胞周围形成一个肉眼可见的圆形透明溶血空斑。每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示产生抗体的多少。另外还有间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC混合时，再加抗-鼠Ig抗体（如兔抗鼠Ig），使抗体生成细胞所产生的Ig与抗-Ig抗体结合成复合物，此时活化补体导致溶血，称间接溶血空斑试验。

溶血空斑形成试验可用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响，或评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的功能。

3.酶联免疫斑点技术　该技术的原理是用抗原包被固相载体，加入待检的抗体产生细胞，诱导抗体的分泌。分泌的抗体与包被抗原结合，在抗体分泌细胞周围形成抗原抗体复合物，使细胞吸附于载体上，加入酶标记的第二抗体与细胞上的抗体结合，通过底物显色反应的深浅，可测定生成的抗体量，并可在镜下计数着色的斑点形成细胞。

该技术既可检测抗体分泌的细胞数，又可检测抗体的分泌量。优点是稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；还可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。

（三）NK细胞活性测定

NK细胞具有细胞毒作用，能直接杀伤肿瘤细胞等靶细胞。体外测定NK细胞活性的常用方法有：

1.形态学检查法　以人PBMC或小鼠脾细胞作为效应细胞与靶细胞按一定比例混合共育，继而用台盼蓝等活细胞拒染的染料处理，光镜下分别计数染色的死亡细胞和不染色的活细胞，由此推算NK细胞的杀伤活性。本法简便，易于掌握，但结果受主观因素影响。

2.酶释技术　乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞浆内含的酶之一，当细胞受伤时，细胞膜通透性改变，LDH从胞浆中释放，释放量的多少与细胞受损伤的程度呈正相关。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I变成还原型辅酶I。后者再通过递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化唑蓝（INT）或硝基蓝四氮唑（NBT），形成有色的甲臜类化合物，在570 nm波长处有一高吸收峰，读取A值，计算即可得NK细胞杀伤靶细胞的活性。本法经济、快速简便，可定量。缺点是LDH分子较大，仅当靶细胞膜严重破坏时才释放，故不能较早地反映结果。

3.放射性核素释放技术　应用放射性核素51 Cr或125 IUdR标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击后，靶细胞被破坏，释放出放射性核素，通过测定上清和细胞部分的放射性强度（以cpm值表示）计算NK细胞活性。本方法敏感性高，结果精确，但靶细胞的放射性核素自然释放率较高，⁵¹Cr半衰期短，试验设备要求较高，并存在放射性核素污染。

4.化学发光技术　当效应细胞与靶细胞接触时，效应细胞呼吸爆发，生成极不稳定的O₂^-和OH-等自由基，放出光子，在发光剂存在的条件下，可被光电倍增管接受和计数，发光量与NK细胞杀伤能力相关。本法测定操作简单快捷，样品用量少，是氧化爆发检测中最为敏感，并可直接定量的方法。

5.流式细胞技术　染料碘化丙啶只能渗透到死亡细胞内并与其DNA和RNA结合，在488 nm波长激发下产生有色荧光。另外，NK细胞体积大小以及对光的散射特性皆与靶细胞不同，因此可以用流式细胞仪检测靶细胞受NK细胞作用后的死亡率来反映NK细胞的活性。