（一）实验目的和原理
在DNA复制过程中，核苷的类似物5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxy uridine，简称BrdUrd）或5-碘尿嘧啶核苷（5-Iodo-2′-deoxy uridine,简称IdUrd）可以代替核苷酸掺入新合成的DNA链，并占有胸腺嘧啶（Thymidine,T）的位置。哺乳类动物细胞在含有适当浓度的BrdUrd的培养液中经历2个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体的DNA双链在化学组成上就有了差别：即一条染色单体的两股DNA中的T位完全由BrdUrd代替，而另一条染色单体的两股DNA中的一股含BrdUrd，另一股则不含BrdUrd，这样的细胞经过制片和苯并咪唑荧光染料（Hoechst-33258）染色后，在荧光显微镜下可观察到两条姐妹染色单体显示强弱不同的荧光。两股DNA链都含有BrdUrd的单体荧光较强，其中只有一股有BrdUrd的单体荧光较弱。因此，利用BrdU技术可观测细胞增殖情况；但由于荧光染料发出的荧光消失较快，只能立刻在荧光显微镜下照相而不能长期保存。
（二）实验试剂
增殖试剂盒，70%乙醇固定液（7ml乙醇+3ml50mmol/L甘氨酸pH2.0），3%Triton,染色液。
（三）操作步骤
1.细胞计数，铺96孔板，约2000个细胞/孔，铺板。37℃孵育24h。
2.含1/200底物BrdU的培养液，100μl/孔，37℃培养1h。
3.PBS洗3次。
4.70%乙醇固定液，加入100μl/孔，-20℃放置2h。
5.PBS洗3次。
6.3%Triton透化45min。
7.PBS洗3次。
8.加一抗：现用现配，用孵育缓冲液，1∶15稀释，20μl/孔。37℃2h，4℃过夜。
9.PBS洗3次。
10.加二抗：PBS1∶20稀释，20μl/孔，室温避光30min，观察荧光。
11.染色，照相，计数，计算增殖率。
（四）注意事项
1.细胞状态要好，种植密度要均匀。
2.最好选用4℃过夜，如果选用37℃孵育染色效果不如4℃过夜好。
（五）典型图例
见图1-51。
图1-51 不同处理组细胞的BrdU染色阳性率不同
[1]Liu S,Xie Y,Lv Y,et al.A novel target of mizoribine inhibiting mesangial cell proliferation:S phase kinase-associated protein 2.Am J Nephrol,2010,32:447-55.
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