淋巴细胞增殖实验

时间：2022-05-13 理论教育版权反馈

【摘要】：淋巴细胞增殖实验又称淋巴细胞转化实验。恶性肿瘤和活动性结核、慢性病毒性肝炎患者T淋巴细胞转化率低于正常水平。淋巴细胞转化率可作为测定机体免疫功能的指标之一。淋巴细胞转化率的高低可反应机体的细胞免疫水平。淋巴细胞受到PHA作用后发生增殖，其细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝紫色的结晶甲瓒产物，沉积在细胞内或细胞周围，甲瓒的生成量与细胞增殖水平呈正相关。

实验三　淋巴细胞增殖实验

淋巴细胞增殖实验又称淋巴细胞转化实验。T淋巴细胞在体外受到特异性抗原或有丝分裂原如植物血凝素（PHA）或刀豆球蛋白（ConA）的刺激时，细胞可被活化并转化为T淋巴母细胞，表现为细胞体积增大4～5倍、胞浆增多、核仁明显等形态学明显改变以及细胞内DNA与蛋白质的合成增加，进一步发生细胞增殖。恶性肿瘤和活动性结核、慢性病毒性肝炎患者T淋巴细胞转化率低于正常水平。淋巴细胞转化率可作为测定机体免疫功能的指标之一。测定淋巴细胞转化实验的方法有：形态学检测法，³H－胸腺嘧啶核苷（³H－TdR）掺入法及MTT比色法等。

一、形态学检测法

实验目的

了解检测T淋巴细胞功能的淋巴细胞转化实验的原理及操作过程。

实验原理

T淋巴细胞在受到非特异性有丝分裂原或特异性抗原刺激后，被激活的淋巴细胞的形态和代谢产生一系列变化，细胞转化而出现大量的原淋巴细胞。淋巴细胞转化率的高低可反应机体的细胞免疫水平。

实验材料

（1）标本：肝素抗凝人全血。

（2）细胞培养液：常用RPMI－1640完全培养液，通常取RPMI－1640粉剂10．4g，用三蒸水配制，同时补加青霉素100U/mL和链霉素100U/mL，庆大霉素50U/mL，谷氨酰胺2mmol/L，丙酮酸钠1mmol/L，2－巯基乙醇50μmol/L，用0．22μm滤膜过滤除菌，临用前添加10%小牛血清。

（3）PHA溶液：用Hanks液配成0．5%的无菌溶液。

（4）肝素抗凝管（按1mL血加0．1mL 125U/mL肝素溶液）。

（5）培养瓶（可用青霉素瓶洗净后高压灭菌）、吸管、载玻片、CO₂培养箱等。

（6）瑞氏染液。

实验方法

（1）取肝素抗凝血0．1mL注入含有完全培养液2mL和0．5%PHA溶液0．1mL的无菌培养瓶内，混匀后于37℃温箱中培养72h（或加白细胞介素－2，使其终浓度为20～50U/mL，可培养至第7天）。

（2）培养结束后，弃去大部分培养上清液，再吸取少许沉淀细胞涂片，干燥后用瑞氏染液染色，干燥后用显微镜油镜检查。

实验结果

（1）依据淋巴细胞的体积大小、细胞质染色性、核浆比例以及核仁的有无等标准将T淋巴细胞划分为四个时相。

①分裂象：处于有丝分裂期的T细胞，染色体明显。

②母细胞型：其特点为细胞体积增大4～5倍；细胞核增大，疏松呈网状结构，并有1～3个核仁；细胞核周围有半月形或环状染色较淡的透明区；胞浆丰富，并常见空泡。

③过渡型：比小淋巴细胞体积略大，胞浆着色较淡；核内略疏松，核仁有或无。

④小淋巴细胞型：核染色质致密，无核仁；核浆比例大；胞浆很少，呈现轻度嗜碱性。

（2）淋巴细胞转化率的计算：计数200个淋巴细胞，依照以下公式计算T淋巴细胞转化率。

二、³H－TdR掺入法

实验目的

了解³H－TdR掺入法检测T淋巴细胞功能的原理及操作过程。

实验原理

T淋巴细胞大多处于细胞周期的G₀期，当受到有丝分裂原或特异性抗原刺激激活后，从G₀期进入G₁期，然后进入S期，细胞合成DNA量倍增。此时将³H－标记的DNA前体（胸腺嘧啶核苷，³H－TdR）加入到培养系统内，³H－TdR作为DNA合成的原料被转化的细胞摄入，即掺入新合成的DNA中。培养结束，离心去除掺入的³H－TdR，测定淋巴细胞内放射量，即可推断淋巴细胞的转化程度。

实验材料

（1）标本和培养液，同形态学检测法的。

（2）³H－TdR放射性限度为（5．5～7．4）×10¹²Bq/mL，用时每管加20μL，终浓度为3．7×10⁴Bq/mL。

（3）闪烁液：2，5－二苯基恶唑（PPO）4．0g，1，4－双（5－苯基恶唑基－2）苯（POPOP）0．4 g，无水乙醇200mL，二甲苯800mL。

（4）主要器材：液体闪烁仪，闪烁瓶，离心管等。

实验方法

（1）取肝素抗凝血0．1mL注入含有完全培养液2mL和0．5%PHA溶液0．1mL的无菌培养瓶内，细胞孵育72h至收获。在培养结束前16h，于各培养瓶中加入0．2mL³ H－TdR终浓度为7．4×10⁴Bq/mL（0．2mL）。

（2）培养结束，将每管摇匀，加双蒸水6mL，低渗破坏红细胞，加入35．0g/L NaCl 2 mL调至等渗状态。

（3）离心洗细胞（1 500r/min离心10min），弃上清液。各管加入2mL生理盐水后混匀，用毛细吸管吸取细胞悬液滴入装在抽滤装置上的49型玻璃纤维中央，用生理盐水冲洗样品管，使其全部滴在玻片上。

（4）抽滤干后，再加20mL双蒸水抽滤，冲洗，使残留在滤片上的红细胞完全溶解。

（5）滴加50．0g/L三氯醋酸5mL，固定样品，然后滴加无水乙醇2mL脱色、脱水。

（6）取下滤片、编号标记、置于80℃烘箱中30min或置于37℃温箱中过夜。

（7）将干燥的滤片浸入盛有10mL闪烁液的测定瓶中，使滴加样品的一面向上，置液体闪烁仪中测定每分钟脉冲数（counts per minute，cpm）值。计算刺激指数（stimulation index，SI）。每个标本通常测3～4个复本并求其平均值。

实验结果

每批实验应设对照组，按下列公式计算结果。

注意事项

（1）放射性核素掺入法的影响因素较多，如培养时间、PHA浓度、³H－TdR的活性等，因此各实验室应严格控制实验条件。

（2）放射性核素容易造成环境污染，必须在相应的实验室进行。

三、MTT比色法

实验目的

了解MTT比色法检测T细胞功能的原理及操作过程。

实验原理

MTT全称为3－（4，5）_－dimethylthiahiazo（_－z－y1）_－3，5－di－phenytetrazoliumromide，化学名为3－（4，5－二甲基噻唑－2）_－2，5－二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中。淋巴细胞受到PHA作用后发生增殖，其细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝紫色的结晶甲瓒产物，沉积在细胞内或细胞周围，甲瓒的生成量与细胞增殖水平呈正相关。盐酸异丙醇或二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标测定仪检测细胞培养物的A570nm值，通过刺激指数（SI）可判断淋巴细胞的增殖情况。

实验材料

（1）细胞培养液、96孔板。

（2）MTT液：1mg/mL，称取MTT 0．1g，溶于100mL磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0．22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存（在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住）。

（3）0．01mol/L盐酸－异丙醇。

（4）酶联免疫测试仪，细胞培养箱等。

实验方法

（1）接种细胞：用含10%胎、小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1 000～10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200μL。

（2）培养细胞：同一般培养条件。

（3）呈色：培养结束前，每孔加MTT溶液10μL，继续孵育4h，终止培养。

（4）各孔加入0．01mol/L盐酸－异丙醇100μL，30min内用酶标仪测A570值。

实验结果

注意事项

（1）选择适当的细胞接种浓度。

（2）避免血清干扰：一般选浓度低于10%的胎牛血清培养液进行实验。

（3）设空白对照。

四、流式细胞术检测淋巴细胞增殖实验

实验目的

了解流式细胞术和活细胞荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯的淋巴细胞增殖实验的免疫学检测方法。

实验原理

羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（5，6－carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）是一种特殊的荧光染料，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并与细胞内蛋白共价结合，水解后的CFSE释放出荧光物质，这些共价结合的荧光物分子不易从细胞内脱落，标记的细胞在生理活性等特征上无明显变化，而且能够随细胞分裂进入到子代细胞。细胞内CFSE减少的唯一途径就是细胞增殖，当细胞分裂时，CFSE标记物可平均分配到子代细胞中，各连续代细胞以荧光强度递减一半为特征，当用流式细胞仪分析时会呈现明显的分裂峰。

实验材料

（1）采血用注射器，含抗凝剂试管，流式试管（兼作染色和测定用）。

（2）移液器（10～20μL，100μL和1mL），移液器头，离心机，培养箱。

（3）溶血剂，缓冲液（洗涤用），固定剂（1%PFA）。

（4）荧光抗体：①CD4－PE；②CD8－PE；③CD3－Biotin和SA－PeCy5CD3－PE；④CD8－PE；⑤CSFE。

（5）刺激剂：PHA。

（6）FACS Aria（BD公司）。

实验方法

（1）CFSE标记外周血单个核细胞（PBMC）：CFSE溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成储存液（2mmol/L），分装后于－20℃保存。健康人外周血经肝素抗凝后用淋巴细胞分离液分离获得PBMC，用PBS配制成细胞数为2×10⁷个/L的细胞悬液。每毫升细胞悬液加入0．5μL CFSE储存液，终浓度为1μmol/L，37℃染色10min后，用含100mL/LNBS的1640完全培养液洗2次后将染色后PBMC制成细胞悬液（1×10⁶个/L）。

（2）T淋巴细胞的激活与扩增：将上述PBMC细胞悬液加入24孔培养板，每孔1mL，加PHA 10μg/mL。于37℃CO₂的培养箱中培养，每隔3d加入IL－2（50U/mL）以扩增细胞。

（3）流式细胞术检测和分析T淋巴细胞亚群的增殖：用PHA刺激培养3d后，收集细胞，用抗CD4－PE、抗CD8－PE、抗CD3－Biotin和SA－PeCy5作细胞表面分子染色，然后在流式细胞仪上检测，以CFSE为第一荧光（FL1），PE标记抗体为第二荧光（FL2），Pe－Cy5为第三荧光（FL3），用CELL Quest软件获取数据，然后用ModFit软件分析不同T淋巴细胞亚群的增殖动力模型（图6－1）。

实验结果

流式结果显示：未加入刺激物培养的对照组中其单个核细胞CFSE荧光强度基本一致，没有发生明显的增殖改变，表现为一个主要单峰，而加入PHA共同培养的刺激组人单个核细胞则发生了显著的增殖，表现为一系列CFSE荧光强度呈对半递减的子峰（可配合PE标记的抗人CD4、CD8mAb染色，通过流式细胞仪可针对不同淋巴细胞亚群增殖进行进一步分析）。