激光扫描共聚焦显微镜的基础知识

第一节　激光扫描共聚焦显微镜的基础知识

一、基本原理

传统的荧光显微镜使用的是场光源，因标本邻近结构（细胞或亚细胞结构）产生的衍射光和散射光的干扰，使标本中细微结构的成像不够清晰，分辨率较低。激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描技术，以激光为光源，通过照明针孔在样品的某一个深度形成一个点状大小的点光源，对标本内焦平面的每一点扫描，被照射点的反射光被物镜收集并且通过光路返回，经光束分离器后进入探测针孔，然后被引导至光电倍增管（PMT）。聚集平面内各个像素点的荧光强度被光电倍增管收集、放大，同时显示在计算机监视器上，产生高清晰度的图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，使来自焦平面的光会聚在针孔内，而样品中高于或低于焦平面的反射光以及杂散光均被遮挡掉，保证来自焦平面的唯一信息到达探测器，从而极大地提高了观察生物样品的清晰度。在显微镜的载物台上加一个微量步进马达，控制载物台的升降，可以按微米间距步进上下移动，最小步进距离为0.1μm，所以它能对样品进行连续断层扫描，而无须对样品进行任何切割，细胞或组织各个横断面的图像都能清楚地显示，实现了“光学切片”的目的，因此又称为“细胞CT”。一系列的数字化信号可以由计算机存储和分析，通过计算机软件将数字化的连续切片图像进行三维重组，就可以较客观地观察到重建对象的空间构型。若间歇或连续扫描样品的某一段面（或一条线）并对其荧光进行定位、定性及定量分析，这可实现对该样品的实时监控（图9－1）。

图9－1　激光扫描共聚焦显微镜的基本原理

二、激光扫描共聚焦显微镜的基本组成

激光共聚焦显微镜是一种用于图像采集和分析的大型精密仪器。主要由以下几部分组成：激光光源、扫描器（内装有针孔光阑、分光镜、发射荧光单色器及检测器）、荧光显微镜（装有微量步进马达）系统、光学装置、计算机图像存储与处理及控制系统。现代激光扫描共聚焦显微镜各部分的设计应用了先进激光技术、光学显微镜技术、计算机控制及图形处理技术和精密机械技术，整个系统由共聚焦显微镜专用的计算机软件统一精确的控制，从而保证各部分的协调的工作（图9－2）。

1.激光光源　激光扫描共聚焦显微镜将传统荧光显微镜的汞灯或氙灯光源改为激光光源，就是利用了激光特有的优势。激光由激光器产生，不仅具有普通光的一切性质还具有自己独特的优势：①激光比普通光单色性好；②激光发出的激光束都是相当好的平行光束，具有很好的方向性；③激光亮度高，强度大；④激光的相干性和偏振性好。激光扫描共聚焦显微镜要求光源单色性好、亮度高，而激光光源正好可以满足。采用激光光源成像，系统色差小，尤其是对大数值孔径、高放大倍率的显微镜可提高其光学系统的分辨能力。

图9－2　共聚焦扫描及检测装置

2.扫描器　内封闭有监测针孔光阑、分光镜、发射荧光分色器及检测器。荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔光阑，分光镜和分色镜选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共聚焦图像，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图像及其合成图像。

3.共聚焦使用的荧光显微镜的特点和要求　荧光显微镜是共聚焦显微镜的一个重要组成部分。它配备两个光源，卤素灯光源和汞灯光源，主要是用于预览样品。①卤素灯光源：用于寻找样品焦平面，观察样品位置、形态和分布；②汞灯光源：用于观察和分辨样品中产生的荧光物质的成分和位置。共聚焦显微镜使用的荧光显微镜大体与常规的荧光显微镜相同，具有以下特点：①荧光显微镜的载物台上装有微量步进马达，以驱动载物台在垂直（Z轴）方向移动，用于共聚焦显微镜获取不同层面的光学切片；②荧光镜座要装有防震动装置，防止在激光扫描样品和采集图像过程中载物台发生移动；③装有光路转换器，预览时使用汞灯做为激发光，样品发射的荧光进入目镜或照相系统，采集共聚焦图像时用激光光源激发样品，发射的荧光进入扫描头中的监测器；④荧光显微镜的参数要与光路系统，计算机控制软件相匹配。

4.计算机系统　共聚焦新显微镜的仪器的各个部分由计算机予以设置和控制，使光线精确的按照设计要求扫描样品，所有检测信号均可被储存于多维的图像储存器内，并对图像的资料作进一步加工处理。

三、共聚焦显微镜的特点

流式细胞仪对悬浮细胞进行分析和测量，具有统计学意义，但无法得到细胞的形态学以及多种动力学功能参数，尤其不能满足细胞的解剖定位研究，而要阐明完整细胞特殊功能的各种细胞组成的作用。多种组分因子的相互作用及其原理，就要求一种技术，能够在同一细胞中对多种结构和功能参数，在时间上进行定量测定，激光扫描共聚焦显微镜术就是应运而生的这样一种先进技术。其特点如下。

1.高分辨率　激光扫描共聚焦显微镜以激光为光源，通过激光和荧光的共聚焦成像以及针孔光阑的应用阻止了焦点以外的干扰衍射光和散射光，因此分辨率与普通荧光显微镜相比得到很大提高。根据物镜的数值孔径的不同，最小可观察厚度为0.5μm，分辨率是普通荧光显微镜的1.4倍（图9－3）。

图9－3　聚焦显微镜的高分辨率

2.灵敏度高　采用光电倍增管来检测荧光，得到一个荧光数字图像。利用其不同的滤光片可将不同的光分开，极弱的荧光也可检测得到，因此灵敏度高。

3.扫描速度快，可动态检测　利用点扫描或狭缝扫描可很快完成对图像的观察。为观察更快的细胞变化，还可以做线扫描和点扫描，速度分别为毫秒级和微秒级。因此，可以动态观察细胞内化学成分如Ca^2＋、Mg^2＋和pH值的变化。可对膜电位、膜的流动性等进行测定。由计算机对数据进行实时的记忆，储存后再进行图像处理分析。

4.光学切片与细胞CT　激光扫描共聚焦显微镜是利用激光的点光源，聚焦在样品的一定深度下照射成像，要得到样品完整的图像信息，必须是入射点在垂直于显微镜光轴的焦平面（X－Y轴）上，样品进行逐点或逐线扫描，经计算机进行采集、储存、处理，转换合成一定大小的二维图像。这实际上是样品微小厚度内平面切片图像，进行切片的厚度由通过点光源的针孔大小决定，这与医学诊断中“X线CT”图像原理极为相似。我们可以调整聚焦点在样品中的深度得到样品不同深度（Z轴）的切片图像。将样品不同深度的切片图像叠加在一起进行三维重组，观察不同断面中细胞成分的变化，即细胞CT。这是激光共聚焦显微镜的又一大特点。

5.图像存取方便　图像处理和定量荧光分析，其图像数据通过高灵敏度的电荷耦合件（CCD）采集后，利用计算机可快速及时地保存图像，其数据存取方便，可随时调用。这样，一方面为动态分析图像数据准备了前提条件；另一方面也避免了荧光样品不易保存的缺点。激光扫描共聚焦计算机系统装备有图像分析系统，因此它可以利用其数据分析软件，对样品的荧光强度进行定量分析。可提供细胞的平均荧光值、荧光积分值、周长、面积等数据。

6.共显像　多通道采集图像的功能很方便地使共聚焦显微镜具有同时获取不同光谱段的荧光信号的功能，并通过软件处理得到层叠效应图像及通过补偿设置可以消除不同荧光信号之间的干扰。总之，激光扫描共聚焦显微镜对荧光样品的观察具有明显的优势。只要能用荧光探针竞相标记就可以用它进行观察和定量分析，可广泛用于形态学、生理学、生物化学、药理学、细胞生物学和分子生物学等方面的研究。