技术检测细胞间通讯

（一）实验原理及目的

以细胞间的缝隙连接（gap junction）为途径进行的细胞间直接的信息交流，称为缝隙连接细胞间通讯（gap junction inter-cellular communication，GJIC），是细胞间通讯的主要方式。GJIC可协调不同细胞、组织间的代谢或电传导，使各种信息有效地到达相应的细胞、组织；与胚胎发育、细胞分化过程有密切关系；是调控细胞生长控制、细胞凋亡、细胞衰老的重要途径。

过去已有多种技术途径用于功能性GJIC的研究，包括：膜片钳，放射性活性代谢物转移，微注射，荧光染料的转移刮除负载（Scrape loading）和荧光染料的转移等方法。但是，这些方法均存在不同程度的缺陷，使缝隙连接通讯的研究受到限制。目前，荧光光漂白恢复（Fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）技术能够借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭，再用低强度激光扫描，可通过检测该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率，来研究细胞间缝隙连接通讯。从而，大大拓展了人们的研究手段，使细胞间通讯的研究更进一步深入。

（二）主要实验材料

6-CFDA/AM探针、肾小球系膜细胞、含有Ca2+，Mg2+的PBS等。

（三）实验流程

1.6-CFDA/AM粉剂溶于二甲基亚砜（DMSO）中配成1mg/ml的储存液，-20℃保存。染色时用含有Ca2+，Mg2+的PBS稀释。

2.将培养好并且加药的细胞先用含有Ca2+，Mg2+的PBS清洗2次，加入10μl的CFDA，使终浓度为50μmol/L。

3.在37℃5%CO2孵箱中孵育10min，取出用含Ca2+，Mg2+的PBS洗掉多余的CFDA，然后再加入少量培养液。

4.选择细胞进行检测

（1）第一种选择细胞间存在间隙连接通讯，而且细胞间处于连接状态，是我们实验数据的来源。

（2）第二种选择与其他细胞相分离的，根本不存在间隙连接的细胞，用于实验对照。这种细胞选择的原因是因为荧光物质即使在无激光照射下，也有自身的荧光光白作用。

（3）第三步选择空白区域作为背景校正。

5.启动共聚焦显微镜，选择488nm氩离子激光。启动计算机，运行扫描软件，扫描图像。

6.仪器参数的设定　在仪器参数设置中最为重要的是光电倍增管强度（PMT），扫描强度、淬灭强度和淬灭时间。光电倍增管强度和扫描强度的设置，以能清晰观察细胞为标准，要求尽可能的小，以减少光漂白对细胞造成的影响。淬灭强度必须大于扫描强度，并和淬灭时间相配，使被淬灭细胞的荧光强度在淬灭前的30%～60%为合适。

7.以OlympusFV1000为例，运行FV10-ASW2.1软件中的光刺激程序，选中MAIN；选中ROI选择键；在图像上选择需要漂白的区域；选中用于漂白的激光器，一般只选405nm激光，并根据漂白情况选择漂白激光强度；输入需要漂白的时间或幅数，根据实际漂白效果，如果很快漂白则输入值低一些，如果漂白慢则输入值大一些；输入等待FRAM数，一般输入1～10个都可。

8.执行XYt扫描。

9.由于每个细胞活性不同，生长周期不同，因此它的荧光漂白后恢复速度也会与其他细胞不一致。所以必须设置多个细胞进行观测，避免个体差异。实验中应每个浓度在96孔板上设置6个孔，每个孔至少观察10个细胞，这样每个数据至少由60个细胞数据统计产生。

10.选定ROI进行荧光漂白与恢复分析　首先比较各样品ROI在荧光漂白前、漂白结束后、荧光恢复后的图像差异,然后比较不同样品ROI的荧光漂白恢复曲线的变化差异,计算荧光漂白恢复率R。R=（Ir-Ib）/（Ip-Ib）,其中Ir为荧光恢复后的荧光强度，Ib为荧光漂白后的荧光强度，Ip为荧光漂白前的荧光强度。

11.最后将数据输入excel进行整理、统计、分析。

（四）典型举例

我们应用FRAP技术和分子生物学、细胞免疫化学等方法，从功能、基因、蛋白质表达几个层次的研究表明高糖可抑制系膜细胞间通讯功能，见图1-39。

图1-39　6-CFDA/AM染色后，系膜细胞的选择及不同细胞的荧光曲线不同阶段（淬灭前、淬灭、荧光恢复阶段）典型图像（×600）

（五）注意事项

1.必须选择相互连接的细胞（2～3个细胞相连），否则实验不能得出结果；但是不能选择4个以上相连的细胞。

2.同一培养皿的细胞尽量在30～40min扫完，否则由于细胞暴漏在空气中时间过长将影响检测结果，或者选择配有活细胞培养系统的共聚焦显微镜。

3.淬灭时间不能过长，否则细胞内荧光将不能恢复，影响实验结果的准确性。

4.必须设阴性对照，有时通过阴性对照的校正，才能观察出阳性细胞的统计学意义。

参考文献

[1]Zhang X,Chen X,Wu D,et al.Downregulation of connexin 43 expression by high glucose induces senescence in glomerularmesangial cells.J Am Soc Nephrol,2006,17:1532-1542.