（一）外周血单个核细胞（PBMC）分离
1．原理 外周血中各种细胞的比重各不相同，如单个核细胞（单核细胞和淋巴细胞）的比重介于1．075～1．090，粒细胞与红细胞在1．092左右，血小板在1．030～1．035，因而利用一种比重介于1．075～1．092的溶液进行密度梯度离心，使细胞按一定比重的相应密度梯度分布而加以分离。
2．细胞分层分离试剂 常用的分层液有Ficoll与Percoll两种。
（1）Ficoll分层液法：是一种主要用于分离外周血中单个核细胞的单次密度梯度离心分离法，离心后由上到下分层依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。
（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其由上至下分层依次为：死细胞层、富含单核细胞层、富含淋巴细胞层、红细胞与粒细胞层。
（二）淋巴细胞的分离
1．淋巴细胞的分离 在37℃和Ca2＋存在时，单核细胞能主动黏附在玻璃、塑料、棉花纤维、尼龙毛或葡聚糖凝胶，而淋巴细胞无这种黏附性。因此利用黏附贴壁法、吸附柱过滤法和磁铁吸引法等，可从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
2．T淋巴细胞亚群的分离原则
（1）阳性选择法：根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞，如E花环沉降法、亲和板结合分离法、荧光激活细胞分离仪分离法。
（2）阴性选择法：选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞，如尼龙毛柱分离法、磁性微球分离法。
3．淋巴细胞活力测定 最简便常用的是台盼蓝染色法。台盼蓝是一种阴离子型染料，不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色；但死细胞因膜通透性增加，染料可以进入细胞内使死细胞染成蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。
（三）T细胞表面标志的检测
成熟T细胞膜表面有TCR、CD3、CD4、CD8、CD2等独特标记。
1．表面抗原检测 利用CD抗原（如CD3、CD4、CD8等）单克隆抗体（McAb）检测T细胞表面抗原，可用标记抗体染色法（如免疫荧光法、酶免疫法、免疫金银染色法）和花环试验法（如用CD3－McAb致敏的红细胞与T细胞结合成花环）。
2．表面受体检测 T细胞与绵羊红细胞（SRBC）悬液按一定比例混合后，T细胞的E受体（CD2）可结合SRBC形成玫瑰花环。
（四）B细胞表面标志的检测
B细胞膜表面有BCR（mIg）、CD79、CD5、CD19、CD21、CD23等重要标志。
1．表面抗原检测 可用相应CD单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化法或ABC法检测。
2．mIg的检测 可分别用抗各类Ig（IgM、IgG、IgA、IgE、IgD）的荧光（或酶）标记抗体染色，检测带有相应mIg的B细胞。当mIg与荧光抗体结合后可出现交联现象，连成斑点和帽状，时间长了帽状结合物可脱落或被吞饮而消失，因此观察时间不能超过30min，或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮。
（五）T细胞功能的检测
1．T细胞转化试验 在细胞培养液中加入植物血凝素（或刀豆蛋白A、美洲商陆），外周血中的T细胞受刺激活化，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞，称为T淋巴细胞转化。
2．T细胞转化试验类型
（1）形态法：据细胞的大小、核与胞质的比例、胞质的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡性母细胞、核有丝分裂象以及小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，计算转化率。
（2）核素法：外周血T细胞一般处于细胞周期的G0期，若在培养液中加入PHA，T细胞激活后从G0期进入G1期，然后进入S期，开始大量复制DNA，若此时加入3 H标记的胸腺嘧啶核苷（3 H－TdR），T细胞新合成的DNA链中会掺入3 H－TdR，可用液闪仪检测记录脉冲数，推测细胞增殖程度。
3．T细胞介导的细胞毒试验 T细胞某种抗原致敏后，致敏T细胞再次遇表达相应抗原的靶细胞，可杀伤和破坏靶细胞。这是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。
（六）B细胞功能的检测
1．溶血空斑形成试验 常用直接溶血空斑形成试验，其方法是：用SRBC免疫小鼠，取其脾细胞与SRBC及补体混合在琼脂凝胶层内，置37℃温育。由于抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，在补体参与下导致SRBC溶解，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区（空斑）。每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示细胞产生抗体的多少。
此外还有间接溶血空斑形成试验法、非红细胞抗体溶血空斑试验和反相空斑形成试验。
2．B细胞增殖能力的试验 细菌LPS、SPA和抗IgM抗体均能刺激B细胞增殖，培养1～3d以后，加3 H－TdR，与淋巴细胞增殖试验一样，检测细胞内cpm，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。
（七）NK细胞功能的检测
一般用K562细胞株作为靶细胞测定人NK细胞活性，用YAC细胞株测小鼠NK细胞活性，检测方法有形态法、酶释放法、荧光法、核素法和化学发光法。
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