粒细胞抗体检测

【原理】荧光免疫法检测：粒细胞和受检血清中的粒细胞抗体结合后，再加荧光标记的羊抗人IgG抗体，在荧光显微镜下计数出现荧光的粒细胞阳性比率。

【试剂】

1.2.5%EDTA-Na2溶液。

2.EDTA-Na2-Tris缓冲液　EDTA-Na20.9g，Tris 6.06g，NaCl 16.13g，加蒸馏水至1000ml。

3.1%EDTA-Na2-磷酸盐缓冲液 EDTA-Na2 10g，NaCl 8g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，加蒸馏水至1000ml。

4.粒细胞分离液

（1）比重1.097聚蔗糖-泛影葡胺混合液：14.6%聚蔗糖24ml，34%泛影葡胺10ml，如比重小于1.097，用34%泛影葡胺调节。比重大于1.097，用14.6%聚蔗糖调节。

（2）比重1.077聚蔗糖-泛影葡胺混合液：即市场有供应的淋巴细胞分离液。

5.1%甲醛磷酸盐缓冲液。

6.磷酸盐缓冲液（PBS） NaCl 8.0g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KCl 0.2g，加蒸馏水至1000ml。

7.0.2%牛血清清蛋白磷酸盐缓冲液。

8.荧光素标记兔（或羊）抗人免疫球蛋白血清。

9.“O”型健康人粒细胞悬液

（1）取数支试管，各管加入比重1.097聚蔗糖-泛影葡胺混合液2ml。沿管壁缓慢地加入比重1.077聚蔗糖-泛影葡胺混合液2ml，使后者分离液重叠在1.097分离液的上面。

（2）另取一支试管，加入2.5%EDTA-Na2溶液1ml和“O”型正常人血液9ml，混合。用EDTA Na2-Tris缓冲液将抗凝液作4倍稀释（抗凝血液1份+缓冲液3份）混匀。将稀释的正常人血液用吸管沿管壁缓慢地加于上述含粒细胞分离液的试管内，每管加6～7ml，使稀释血液重叠在比重为1.077分离液上面。

（3）转速800r/min，离心30min。离心后可分成3层细胞，底层是红细胞层，上层是淋巴细胞和血小板层，而中间层为粒细胞层。

（4）用吸管将上层清液、淋巴细胞和血小板层吸去。将中层的粒细胞全部吸于另外2支试管中，加入0.1%EDTA磷酸盐缓冲液至近管口，颠倒混匀。转1300r/min，离心5min。

（5）弃去上层液体，将分离所得的粒细胞用1%甲醛磷酸盐缓冲液固定5min。用PBS洗涤3次，最后用PBS配成粒细胞数为10×109/L的粒细胞悬液。

10.制备患者血清。

【操作】

1.取2支试管，测定管中加入患者血清0.1ml和“O”型正常人粒细胞悬液0.1ml，对照管加入健康人AB型血清0.1ml和O型正常人粒细胞悬液0.1ml。

2.混合，在37℃中放置30min。

3.分别用0.2%牛血清清蛋白缓冲液将粒细胞洗涤3次。

4.加入荧光素（异硫氰酸）标记兔（或羊）抗人免疫球蛋白血清0.1ml，混和，37℃中放置30min。

5.用0.2%牛血清清蛋白缓冲液洗涤3次。

6.各取1滴粒细胞悬液置于玻片上，用荧光显微镜观察粒细胞是否出现荧光，记录具有荧光粒细胞的百分率。

【注意事项】

1.取新鲜全血，尽快收集血清，若不能马上测定应冷冻保存。

2.每次洗涤要充分。所用器材应清洁、消毒。

3.荧光染色后的标本最好在当天观察，否则随时间延长荧光强度会逐渐下降，所以标本不能长期保存。

【参考值】阳性反应表示受检血清中存在粒细胞抗体。

【临床意义】

1.阳性反应表示粒细胞抗体的存在，可见于免疫性粒细胞抗体减少症、系统性红斑狼疮（SLE）和多次输血者。

2.本法敏感性好，特异性较强。