实验室检测

1．病毒分离法

（1）常规病毒分离法：即病毒培养及病理鉴定，为HCMV实验室诊断的金标准。该方法是将检测标本（血、尿、唾液、腹水、脐血、脑脊液、气管灌洗液等）接种于人纤维母细胞后观察细胞病理学变化，可见受感染细胞体积增大3～4倍，细胞质内首先出现嗜碱性包涵体，继之在细胞核内出现嗜酸性包涵体。嗜酸性包涵体的周围有一透亮晕环与核膜分开，酷似猫头鹰眼，颇具特征性。但因HCMV只能在人纤维母细胞中增殖，且速度非常缓慢，检测周期需7～21d，不适宜作为临床快速检测方法，现主要用于科研方面。

（2）快速病毒分离法：是将标本接种于人二倍体细胞（通常是人胚肺成纤维细胞）中，经36℃培养16～36h后用巨细胞病毒（CMV）的即刻早期蛋白的单抗进行免疫荧光或酶联免疫法检测。据文献报道，该法与常规病毒分离法比较，特异性相近，敏感性提高，检测时间缩短。故此法常被用作HCMV感染的确认实验。

2．血清中特异性抗体的检测　HCMV感染后可刺激人体产生特异性IgM，IgG，IgA和IgE，通过检测血清中CMV－IgM及CMV－IgG可间接证实体内HCMV的存在。经典的CMV－IgM抗体在原发性感染后迅速产生，几个月内可持续存在，个别患者在继发性感染中也可检测到CMV－IgM抗体。而CMV－IgG在原发性感染后也可迅速产生并在人体内持续存在。最近对肾移植受者移植前抗体的研究表明，接受肾脏移植前的患者HCMV－IgG表达情况是影响移植术后患者存活率的重要因素之一，其中发生HCMV感染风险最低的是供体和受体的抗体均为阴性；发生HCMV感染最高的是供体血清中的抗体为阳性而受体血清中的抗体为阴性。大多数的患者在移植前均带有特异性的抗体，机体表现为持续的CMV－IgG血清检测阳性，但是CMV－IgM血清检测却是阴性。有研究表明，IgM抗体诊断HCMV感染的敏感性仅为42．9%，特异度为78．3%，阳性预测值37．5%，阴性预测值为81．8%。IgM抗体是否转阳以及转阳的时间和临床症状之间无明显相关性。虽然HCMV抗原血症检测已在国内大移植中心运用于HCMV感染的诊断，但是该方法受操作者的技术等诸多因素影响，而且阳性结果也无法区分潜伏性或是活动性感染，假阳性率高，应用受到一定限制。若IgM滴度迅速增加后IgG滴度才增加表示HCMV为原发感染；若IgM和IgG平行增高表示为继发感染，IgM阳性或IgG滴度比原值增加4倍以上表示HC－MV活动感染。IgM抗体2～4周后才下降消失，IgG常保留数月后才下降。感染后2～4周才会出现抗体，此检测对早期诊断不适宜。

此外，还有研究报道使用CMV－IgG亲和力试验来检测患者的感染情况，但是由于检测的方法烦琐，需要应用计算机可视数据采集并进行分析，很难在临床得到推广。

3．HCMV　DNA的PCR检测　HCMV的PCR－DNA检测分为定性、半定量及定量检测等。

定性PCR是一种早期使用于检测HCMV感染的分子生物学方法。但是由于PCR技术高度敏感，即使在HCMV－IgG阴性的正常人或输血后也可出现一过性的PCR阳性，操作过程中的交叉感染也可导致部分假阳性结果，此部分PCR阳性的患者并不代表HCMV处于活动状态，如单纯以PCR阳性作为HCMV预先清除治疗的指标，不但增加患者的经济负担，也使得患者对细菌及真菌的易感性增加。因此，定性PCR不能区别潜伏性感染和活动性感染，结果对于临床监测HCMV感染有一定的局限性。此外，由于功能和方法学方面的限制，如RNA的不稳定性，冗长的RNA分离和RT－PCR的限制性等，大大地限制了病毒RNA在HCMV活动性感染诊断和监测上的运用。有研究报道半定量PCR方法对移植患者的诊断作用还需进一步探讨。现在临床应用及研究较多的是定量PCR，它是1998年由Robert等在检测肾移植受者外周血中白细胞内的CMV－DNA中建立的起来的，并发现移植后病毒含量超过1　000拷贝／105白细胞患者均发生CMV病。以1　000拷贝／105白细胞为CMV病的阈值，其敏感性为35%，特异性为100%。有研究对30例肾移植术后患者12周内每周检测pp65抗原、血浆HCMV定性PCR、血浆和外周血白细胞定量PCR，结果表明，外周血白细胞HCMV　DNA定量检测是最早出现阳性结果的方法，在症状感染前9～10d即可检出。定量PCR检测有两种量化技术：一种是PCR－ELISA，扩增的产物通过与包被在微孔板内的特异性探针结合，用ELISA法对扩增产物定量；另一种是荧光定量PCR（fluorescence quentitative PCR，FQ－PCR）技术，其方法主要是把基因扩增、分子杂交及荧光化学合为一体，使PCR扩增、产物分析的全过程在单管封闭条件下进行，解决了PCR扩增产物污染和不能定量的问题。其具有很好的基因定量的精确性，精确程度可达到0．01fg水平，可以真实地反映出病毒感染和DNA复制量的关系，通过病毒负荷判断感染的严重程度，指导临床用药和疗效观察。应用FQ－PCR技术进行CMV病毒基因的精确定量分析，不仅有利于了解孕妇潜伏性感染的严重程度，也可以从量化的角度分析宫内感染的母婴传播机制，预测胎儿的感染情况。用FQ－PCR检测器官移植术后病人HCMV感染情况，其敏感性可以超过pp65法，可对HCMV感染后产生症状进行预测及对抗病毒治疗进行监测。

此外，有报道在肾移植术后患者采用巢式PCR来检测HCMV的DNA，认为巢式PCR是一种敏感、快速诊断HCMV感染的方法，灵敏度及特异性均高于传统ELISA法，并能弥补ELISA的假阴性。不仅为临床HCMV疾病的诊断与治疗，同时也为选择普遍性预防抑或症状发生前的预先治疗提供可靠的实验室依据。

4．抗原学检测　HCMV为双螺旋DNA病毒，其基因转录及翻译具有时相性，可分为即刻早期（IE）基因、早期（E）基因及晚期（L）基因，3个阶段中的基因表达产物分别称为即刻早期抗原、早期抗原及晚期抗原。pp65作为一早晚期抗原在感染周期的早晚期均有表达，是活动性HCMV感染时外周血白细胞中的主要抗原，多形核白细胞中的HCMV－pp65抗原已被公认为活动性感染的重要标志。运用免疫组化染色的方法，通过检测荧光素标记的HCMV－pp65单克隆抗体，以阳性白细胞的计数＞9个／105 WBC来预测HCMV活动性感染。抗原染色阳性细胞核呈黄色或棕黄色，阴性细胞核呈蓝色，阳性结果每一张细胞片上（含5万 WBC）阳性细胞总数（抗原指数）来表示。有文献报道，pp65抗原检测能早期的预测HCMV活动性感染的发生，其水平的高低能帮助临床预测发生HCMV感染的可能性，故可指导临床预防性用药，随着HCMV治疗的好转，抗原指数也逐渐下降，治疗无效者抗原指数变化不大或增高，此时可能为药物剂量不足或病毒耐药。本方法检查3～4h即有结果。

此外，有研究报道应用流式细胞技术检测CMV－pp65抗原，这是一种近年来发展起来的比较先进的技术，能定量分析细胞的特异性早期抗原，可快速且准确地反映CMV的早期感染状况。其方法是将白细胞破膜后加入抗HCMV早期抗原的单抗及二抗，用流式细胞仪测定其特异性抗原的阳性率及阳性细胞的平均荧光强度。但是由于实验设备和条件要求较高，在临床上还没有得到推广。

5．HCMV基因转录产物mRNA的检测

（1）HCMV即刻早期基因（IE－mRNA）的检测：HCMV即刻早期基因（IE－mRNA）是调节基因，它的表达产物对宿主细胞的代谢具有多效性，IE基因表达的蛋白可以在易感宿主内的细胞诱导病毒的DNA的复制，最终导致晚期基因的表达；然而，某些感染HCMV的细胞却可以限制IE基因的表达，例如病毒妊娠或流产型感染。除上述情况下，病毒感染后1h即可被检出，故检测IE－mRNA可以达到早期诊断目的。Goossens等的试验研究表明，在HCMV潜伏性感染时，病毒复制的水平低或几乎无细胞转录IE－mRNA，当活动性HCMV感染时，病毒在细胞中的复制会明显地增多，表达IE－mRNA的细胞也会随之增多。IE－mRNA为病毒转录的产物是复制活跃的标志，IE－mRNA的表达与活动性感染关系密切，是病毒活动性感染的早期特异的诊断指标。在早期，临床主要使用RT－PCR来检测IE－mRNA的表达，但是由于RT－PCR的局限性，从而限制了该方法在临床上的应用。此后，有研究报道应用的全血的定量PCR来检测是否有HCMV感染的发生，并认为当全血中的IE－mRNA的表达量超过104拷贝／100μl全血的时候就可以应用抗病毒的药物早期治疗。近年来出现应用核酸基础序列扩增法（NASBA）检测移植术后IE－mRNA。NASBA法是依赖引物的核酸扩增技术，以扩增mRNA为根本目标，可以在2h内使mRNA扩增100万倍。它可以直接扩增mRNA而不需要预先的DNA切割步骤，而且整个过程是恒温的，解决了DNA同时扩增的问题。它将Boom法核酸提取技术和电子化学荧光仪检测系统整合在一起，使mRNA从抽取扩增到读取结果变为一个精简、快速、连续的自动检测过程，减少了人为误差，使结果更客观、准确。另外，整个过程可自动分离检测，最大限度的减少了人为干扰的因素，结果较为客观。建立NASBA法检测IE－mRNA的试验条件：首先合成IE－mRNA的上游引物和下游引物，同时合成钌标记IE探针，以人胚肺成纤维细胞培养的AD169株作为阳性对照，已知病毒培养阴性的标本作为阴性对照，实验方法参照进行。因其准确可靠在国外较大的移植中心受到了重视，并作为临床预防性治疗（pre－emptive therapy）抗病毒治疗的依据。

（2）HCMV晚期基因（L－mRNA）的检测：Greijer等对肺移植术后患者外周血中HCMV的L－mRNA进行定量检测，结果为显示当L－mRNA迅速消失时则提示抗病毒治疗取得良好效果。Oldenbrug等对50例胸部器官移植患者术前和术后外周血中L－mRNA进行检测，并与血清学检测、抗原血症检测和感染的临床症状相比较，提出HCMV　L－mRNA是一项准确性高、特异性强的诊断指标，对药物治疗也有重要意义。故已有越来越多的学者将HCMV的L－mRNA检测用于诊断HCMV感染、指导药物治疗及监测预后等，其临床运用前景较好，但还需对其敏感性及重复性方面加以完善。

pp67是L基因编码的HCMV基质表层蛋白，它是从HCMV的UL－65基因中转录过来的，而该基因仅在活动性感染的时候才表达。pp67基因是晚期结构基因，它的转录表示病毒复制已完成，由于pp67－mRNA的出现较晚，对于临床上早期的预防性的治疗没有起到辅助诊断的作用，但是Mengoli等出pp67－mRNA阳性的HCMV疾病多已侵及内脏，对疾病诊断具有较高的特异性，代表HCMV病已经到了严重程度，只对判断预后具有一定的意义。近年来的研究发现HCMV病毒是一种多嗜性病毒，它在体内的基因表达可以反映在多种细胞中，在其中一些表达相当受限，也就是只有IE基因和E基因，而没有L基因的表达，所谓病毒妊娠或流产型感染。而在其他则又可以是完全性的感染，所谓转录型或延续性感染。这样，在分析HCMV基因在体内的表达时，很重要的是要区分流产型病毒感染（仅有IE和E－mRNA）还是转录型病毒感染（IE，E和L－mRNA），后者导致了病毒的复制、传播或后继疾病的发展。因此，研究认为在应用NASBA法检测骨髓移植术后患者支气管肺泡灌洗液中的pp67－mRNA只能偶然性的发现HCMV感染，并没有足够的敏感性和预测HCMV的感染；但是在B．S．N．Black等对艾滋病病人血液中pp67－mRNA检测却发现可以用来判断HCMV的感染。所以对转录型病毒感染pp67的监测就可以准确地反映出体内HCMV的活动状况。pp67－mRNA的阳性检出在于它标志着HCMV正在处于活动感染期，预示着病情在继续发展。过去研究pp67－mRNA在血中的表达主要是使用RT－PCR，但近年来，随着NASBA方法的使用，pp67－mRNA的NASBA检测方法在更多的移植中心展开。pp67－mRNA检测条件实用客观，简单的阳性或阴性结果即可以准确反映HCMV的活动状况，而以此为依据的抗病毒治疗将会更准确可靠。只有测得L－mRNA才属转录型病毒感染，说明病毒复制、传播或后继疾病发展，此法可以当作一项特异和直接的病毒复制的指标。持久性L－mRNA表示耐药，可改变治疗方案。

综上所述，病毒分离或培养阳性是诊断HCMV感染的可靠指标。此外在HCMV的实验室诊断中，还应该注意的是：①对于抗原血症测试阴性和PCR阴性的患者，可以完全排除HCMV感染的可能；未能从血中培养出巨细胞病毒的结果提示CMV感染的可能性较小，但不能完全排除它的存在；②不能因为在大多数无症状性CMV感染患者中，抗原血症测试和PCR均可产生阳性结果而对那些有类似CMV感染症状的或移植物功能障碍的患者都归为仅仅是CMV感染。