氨基酸检测

近年来，人体内氨基酸水平与疾病之间的关系已逐渐引起人们的关注，如脑脊液中谷氨酸、甘氨酸、门冬氨酸等与癫的关系，心脑血管疾病与血清中半胱氨酸的关系等均十分密切。目前实验室测定氨基酸的方法有许多，包括高效液相色谱法(HPLC)、氧化酶法、毛细管电泳法(CE)、质谱法(MS)、核磁共振波谱法(NMR)等等。

(一)HPLC法

柱前衍生HPLC法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高的优点，已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中应用。常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate，PITC)、异硫氰酸丁酯(butylisothiocyanate，BITC)等。PITC可同时测定伯氨酸和仲氨酸，衍生副产物对测定无干扰，衍生物非常稳定(在干燥条件下可在冰箱中长期储存)，缺点是流动相中的杂质和含硫氨基酸(半胱氨酸和高半胱氨酸)形成的二硫化合物会干扰亮氨酸的测定，不能同时测定胱氨酸和半胱氨酸，样品制备需较长时间(30min以上)，衍生化反应过程中需真空蒸发装置，不利于衍生反应的自动进行。BITC的衍生物稳定，能同时测定半胱氨酸和胱氨酸，试剂有挥发性容易除去，缺点是不能测定组氨酸。

OPA衍生法是目前使用最广泛的衍生技术，具有样品制备简单、衍生化反应迅速、易自动化且高敏感性，试剂自身无荧光不产生干扰峰，色谱图基线比较平稳。OPA与β-巯基乙醇在碱性条件下与伯胺类可迅速反应，生成1-硫代-2-烷基异吲哚衍生物。衍生后生成的氨基酸衍生物不仅可在紫外、荧光、可见光区域进行检测，提高氨基酸的检测灵敏度，而且增强了氨基酸衍生物的疏水性，改善了HPLC的分离性。缺点是OPA不能和仲氨酸反应，衍生物不稳定，信号衰减快，所以须严格控制衍生反应时间。

为获取可靠的实验数据，必须考虑以下几个步骤：

(1)患者准备：在取血样、尿样之前，不能服用任何对分析有干扰的药物如避孕药及某些抗生素。这些抗生素及其代谢产物在色谱分析过程中可以产生额外的峰对氨基酸的分离发生干扰。高蛋白饮食时，血中各种游离氨基酸较进普通饮食为高，特别是脯氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸升高的较明显。此外，在蛋白质摄入量正常的情况下，饭后2～4h血清游离氨基酸常有轻度升高。因此建议清晨空腹采血测定。

(2)样品的收集、离心、储存条件：常温下，谷氨酰胺、天冬酰胺和精氨酸会因分解而浓度降低，其分解产物分别为谷氨酸、天冬氨酸和鸟氨酸，使这三种氨基酸浓度升高。色氨酸可被氧化导致测定结果降低。因此，样品收集与预处理的间隔时间不宜过长。血样收集后应尽快离心，转速应>2500g离心20min(最好用低温离心机)，可以获取满意的乏血小板血浆样品。在进一步处理之前血样应保存在4℃以下。

(3)去蛋白的方法：全血中的半胱氨酸在空气中氧化和蛋白质的巯基(-SH)结合，使血浆中没有胱氨酸，而去蛋白后的血浆由于没形成半胱氨酸-蛋白质连接，无蛋白滤液通过空气氧化仅形成胱氨酸。所以在采血后，应尽快除去蛋白质分子。样品去蛋白的方法主要包括以下几种：酸、有机溶剂、超滤、超速离心等等。超滤和超速离心的缺点是不能完全去除蛋白质，特别是不适合脂血样品的分离。Qureshi研究发现，以30%磺基水杨酸(SSA)或1M高氯酸为蛋白质沉淀剂来处理样品有较高的回收率，而用有机溶剂处理样品后其回收率变异较大。总的来说，采用磺基水杨酸(SSA)处理样品是广泛使用的去蛋白质的方法。去蛋白质的样品应储存在-18℃以防止分解，但仍应尽快分析。

(二)高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法(HPCE)是利用离子在电场力作用下迁移速度的不同对组分进行分离和分析的技术。该法柱效高、分离速度快、样品用量小、仪器简单，特别适用于氨基酸、核酸等生物分子的测定。高效毛细管电泳法主要分为毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱(MEKC)、毛细管凝胶电泳(CGE)等。

(三)质谱法

质谱法分析氨基酸是近年来发展起来的高灵敏分析技术。是将化合物形成离子和碎片离子，按其质荷比(m/z)的不同进行分离测定。包括气相色谱-质谱联用(GC-MS)、串联质谱(MS-MS)、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)等。

HPLC的主要缺点是分析时间较长，试剂消耗量大，同时不能有效地持续保持分析柱的分析能力(柱效下降)，HPCE相对于LC，其分析时间较短，分离能力较强，但检测限(紫外吸收检测器)不及HPLC，且重复性较差。质谱技术亦有操作复杂、重复性较差的不足之处。实践证明，将色谱—质谱联用(HPLC-MS、GC-MS、MS-MS)、色谱—色谱联用(HPLC-HPLC)以及柱切换技术运用到生物样品的分析，不仅可以获取更多的定性信息，而且大大提高了定量分析的准确性。

由毛细管电泳与微芯片制作技术的结合而出现了“微芯片实验室”的概念，该方法具有快速、高通量的优点。现已应用到氨基酸检测、DNA测序和基因诊断。只是由于检测技术的局限性，未能得到广泛的应用。相信不久的未来，随着关键技术取得突破性进展，在一块“微芯片”上进行生物样品分析将成为现实。