流式细胞仪检测细胞周期

（一）目的原理

利用特殊核酸荧光染料［碘化吡啶（pyridinium，PI）、4′6-二氨基-2-苯基吲哚（4′6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）等]标记DNA，通过流式细胞仪检测荧光染料的激发荧光。荧光强度与DNA的含量成量效关系，即DNA含量多少与PI结合量成正比。因此，FCM分析细胞周期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1、S、G2/M期。

（二）试剂与仪器

1.PBS、PI50μg/ml，50μg/mlRNA酶。

2.70%乙醇。

3.400目筛网。

4.流式细胞仪　FC500。

（三）实验流程

1.细胞培养至70%～80%融合时，PBS洗2次，0.25%胰酶消化，收集离心管中。

2.取（1～5）×106个细胞，75%乙醇4℃固定过夜（可于4℃存放1周备用）。

3.测定前离心除去75%乙醇，用PBS洗2次，重悬于0.5mlPBS中。

4.应用Becton-Dickinson流式细胞仪（激发光波长488nm，发射光波长570nm）检测自发荧光。

5.然后样品经50μg/mlRNA酶处理后，用PI50μg/ml于暗处染色30min后上机。

6.应用流式细胞分析仪测量DNA含量，以FS的平均强度来反映细胞的大小。

7.细胞周期变化数据用CellFIT Cell Cycle Analysis Version 2.01.2软件分析；以细胞周期各时相细胞百分率记录数据并分析；细胞增殖指数PI=（S＋G2/M)/(G0/G1＋S＋G2/M）×100%。

（四）注意事项

1.细胞状态要良好，必须计数细胞，染色要充分。

2.细胞染色后及时上机分析，使用PI十分容易粘连细胞，造成管路阻塞。

3.应用分析软件时，如果细胞状态好，图形成正态分布，分析准确率较高；反之，要根据实际情况图形设定门、标尺，尽量减少分析数据造成的误差。

（五）典型图例

见图1-21。

图1-21　不同处理条件下的大鼠系膜细胞的周期表达

FBS.胎牛血清；MZR.咪唑立宾

（六）常见问题及处理方案

1.为什么我做出来的图形不漂亮？峰比较宽?

答：样本处理很重要，CV值最好能够在5左右。如果死亡细胞和细胞碎片比较多，就很容易造成CV值偏大。峰宽加大。

2.为什么上机检测时，发现没有什么细胞呢？

答：可能在清洗过程中，由于转速不够，或者倾倒液体将大量细胞丢失。或者由于过滤不当造成细胞丢失。注意选取底部为尖头的离心管。可用吸管吸走清洗的液体而不是倾倒。

3.为什么每次做的细胞周期数值相差很多，对照组都不一样？

答：细胞周期的检测，每次机器的条件一致的前提下，样本处理的时间也要相同。对于二倍体细胞而言，不同时间检测的细胞各个期的数值时不同的。

4.为什么我的细胞检测总是停滞在G1期？

答：最可能的原因是细胞生长过密，应该尽量把检测细胞的密度调整在50%～80%,生长过密，细胞停滞在G1期。

5.细胞状态不好或者细胞粘在一起，影响周期检测吗？

答：无论是培养过程中，还是样本处理过程中，如果细胞状态不好，很容易造成细胞死亡。细胞粘连在一起，没有形成单细胞悬液，直接的后果就是周期检测中CV值偏大，结果分析很不准确。

6.为什么我的图形中出现双峰？

答：很有可能是细胞染色不充分。细胞管壁的细胞没有吹下来，造成仅有一部分细胞被染色，其他细胞没有被染色或染色不充分。

总结：良好的细胞状态，合理的细胞密度，单细胞悬液，染色充分，分析合理是保证流式细胞周期检测成功的重要条件。

参考文献

[1]Bai XY,Chen X,Sun AQ,et al.membrane topology structure of human high-affinity,sodiumdependent dicarboxylate transporter.FASEB J,2007,21:2409-2417.

[2]Zhuo L,Cai G,Liu F,et al.Expression and mechanism of mammalian target of rapamycin in agerelated renal cell senescence and organ aging.Mech Ageing Dev,2009,130:700-708.

[3]Liu W,Hong Q,Bai XY,et al.High-affinity Na(+)-dependent dicarboxylate cotransporter promotes cellular senescence by inhibiting SIRT1.Mech Ageing Dev,2010,131:601-613.

[4]Liu S,Xie Y,Lv Y,et al.A novel target of mizoribine inhibiting mesangial cell proliferation:S phase kinase-associated protein 2.Am J Nephrol,2010,32:447-455.