淋巴细胞数量测定

二、淋巴细胞数量测定

（一）E花环试验

【原理】

人外周血T淋巴细胞上有绵羊红细胞受体，在一定的试验条件下，其可与绵羊红细胞结合形成玫瑰花样细胞团（见第三章）。

【试剂与器材】

（1）肝素（25 U/mL）、F-H分层液、Hank’s液、1％ SRBC、灭活小牛血清。

（2）水平式离心机、温箱、显微镜、1 mL试管、滴管、注射器、碘酒等。

【操作步骤】

（1）制备1％ SRBC悬液　取脱纤维绵羊血1～3 mL，加等量的Hank’s液，混匀后1 500 r/min，离心5～8 min，洗涤3次，最后用Hank’s液配成1％悬液。

（2）分离淋巴细胞　在血球计数板上计数淋巴细胞，并将其配成1×10⁷/mL浓度的淋巴细胞悬液。

（3）加样与反应　取1×10⁷/mL浓度的淋巴细胞悬液0.2 mL，1％ SRBC悬液0.2 mL和小牛血清0.1 mL，在小试管中混合，置37℃孵育5 min。

（4）涂片与染色　取出后500 r/min，离心5 min，放4℃冰箱20 min。取出后轻轻摇动重新悬浮细胞，加半滴亚甲蓝液，用滴管吸细胞悬液一滴放载玻片上，加盖玻片后于高倍镜下计数。

【结果判断】

高倍镜下计数200个以上的淋巴细胞中TRFC（凡能结合三个以上SRBC者为TRFC）的百分数。

TRFC（％）=TRFC/（未形成花环淋巴细胞数+TRFC）×100％

【注意事项】

（1）待测标本要新鲜，试验用的SRBC要新鲜，脱纤维血4℃保存不得超过10天。

（2）SRBC与淋巴细胞的比例以（16～50）∶1为宜。

（3）E花环计数前，应轻轻悬浮，不能用滴管用力吹打，否则会使形成的花环红细胞脱落。

【临床应用】

（1）测定外周血中的T细胞数，观察受检者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效。

（2）观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶性肿瘤疗效的观察及预后判断等。

（二）免疫荧光技术

【原理】

与一般间接免疫荧光法相同，先用鼠抗人CD分子的单克隆抗体（McAb）与PBMC反应，洗去未结合McAb后，加兔抗-鼠IgG荧光抗体，经反应并洗涤后，于荧光显微镜下观察荧光阳性细胞。

【试剂与器材】

（1）鼠抗-人CD的单克隆抗体（商品试剂）、兔抗-鼠IgG荧光抗体（商品试剂）、10％小牛血清RPM I1640、淋巴细胞分离液等。

（2）水平式离心机、荧光显微镜、细胞计数板、滴管、试管等。

【操作方法】

（1）取肝素抗凝血1.5 mL，加等量的生理盐水混匀，轻轻叠加于3 mL细胞分离液上，2 000 r/min，离心20 min。吸取BPMC层，用RPM I1640洗涤2次，每次1 000 r/min，离心10 min，然后用含10％小牛血清RPM I1640培养液将沉淀细胞配成5×10⁶/mL。

（2）取上述细胞悬液0.1 mL，加相应鼠抗-人CD McAb 0.1 mL（按厂家说明书指示效价稀释至工作浓度）混匀，置4℃45 min。离心弃上清后用RPM I 1640液洗涤2次，弃上清液。

（3）加入最适浓度兔抗鼠IgG荧光抗体0.1 mL混匀，置4℃30 min，用RPM I1640液洗涤3次，每次800 r/min，离心3 min，弃大部分上清液，混匀沉积细胞后滴加于细胞计数板上。

【结果判断】

用荧光显微镜观察，计数200个细胞，以荧光强度≥2+为荧光阳性细胞，计算阳性细胞的百分比。

【注意事项】

（1）待测标本必须新鲜。

（2）按要求次数进行洗涤，保证分离细胞的纯度。

【临床应用】

用于淋巴细胞特异性抗原的检测，对自身免疫性疾病、恶性肿瘤、艾滋病、应用免疫抑制剂的患者等相关疾病的诊断和疗效观察有重要意义。

（三）免疫磁珠分离技术

免疫磁珠分离技术包括直接和间接技术两类。直接技术是将特异性抗体与磁性颗粒（平均直径小于1.5μm）交联，形成免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMB）。IMB可与表达相应膜抗原的细胞结合，用强磁场分离磁珠结合细胞与磁珠非结合细胞，从而对特定细胞进行阳性或阴性分选。

间接技术是用羊（或兔）抗鼠IgG抗体（第二抗体）包被磁性微珠，可与任何已结合鼠源性单克隆抗体（第一抗体）的细胞发生反应，从而对细胞进行分离（图8-2）。

图8-2　免疫磁珠法分离技术示意

（四）流式细胞仪

根据T、B淋巴细胞的表面标志，用适当的荧光素标记特异性单克隆抗体与淋巴细胞反应，通过流式细胞仪测定，即可了解相应细胞的阳性百分比和荧光强度，在应用绝对计数管时还可得到待测样本的细胞浓度（见第六章）。

流式细胞仪分离细胞准确、快速，纯度达90％～100％，回收率高，所分离的细胞可保持无菌，细胞结构和生物活性不受影响。但费用昂贵，拟分离的细胞在混合群体中含量过低时，耗时较长才能获得所需数量细胞。

（五）尼龙棉柱分离技术

利用B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而T细胞则不易黏附的特性，可将两者分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙棉纤维，均匀充填在内径5～6 nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hank’s液浸透保温，将PBMC悬液加入柱内，放37℃温箱静置1～2 h。用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非黏附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。