细胞的制备和活性测定

实验八　LAK/NK细胞的制备和活性测定

实验目的

了解LAK/NK细胞的制备和活性测定的原理和操作过程。

实验原理

将同位素⁵¹Cr或³H－TdR掺入到LAK的靶细胞LiBr（黑色素瘤细胞），然后将靶细胞LiBr与效应细胞（LAK）按一定比例孵育4h，根据细胞上清液中靶细胞被杀伤后所释放的⁵¹Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。

实验材料

（1）细胞系：K562、LiBrIL－2。

（2）10%FCS、RPMI 1640、³H－TdR、⁵¹Cr等。

（3）CO₂孵育箱、β－闪烁仪、γ－计数仪、离心机、培养瓶、培养板等。

实验方法

（1）效应细胞的制备：分离外周血淋巴细胞或制备小鼠脾细胞悬液，按常规洗涤细胞2次，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，即可作为NK细胞的来源。若在细胞培养液中加入IL－2（终浓度为1 000μ/mL），将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养72h，作为LAK细胞的来源。

（2）取对数生长期的靶细胞（K562、LiBr），用RPMI 1640洗涤2次后，调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，加³H－TdR 20uci，37℃孵育2h，每15min轻轻振摇一次。

（3）用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次1 000rpm，10min，调整细胞浓度为1×10⁶/mL。

（4）于96孔培养板中每孔加100μL靶细胞，每份3个复孔。然后在每孔加入100μL效应细胞，最大释放组加入100μL、1%TritonX－100，细胞组加入100μL完全培养基。将细胞置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养4h。

（5）用细胞收集仪收取于滤纸上，烤干后，移入液闪瓶中加入1mL闪烁液，于β－闪烁仪中测cpm值。

实验结果

注意事项

（1）诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作，靶细胞要处于对数生长期。

（2）避免同位素污染。

思考题

何谓LAK细胞？LAK细胞培养中有哪些注意事项？