实验43 白细胞介素-2活性测定
(Interleukin-2 activity assay)
【目的】
1.了解3H-TdR掺入法测定白细胞介素-2活性的原理和方法。
2.了解MTT比色法测定白细胞介素-2活性的原理和方法。
一、3H—TdR掺入法
【原理】
白细胞介素-2(interleukin 2，IL-2)由活化Th细胞产生，是T细胞进行克隆扩增以及维持T细胞在体外生长所必需的一种重要的细胞因子。检测IL-2活性的原理是:由于T淋巴细胞在体外必须有IL-2才能生长，故可选用对IL-2呈依赖性的T淋巴细胞株(如CTLL-2)进行检测。在CTLL-2培养过程中，加入待测标本(如用PHA刺激的PBMC培养上清液)，如果CTLL-2得以生长，表明待测标本中含IL-2。CTLL-2对IL-2的需求，在一定范围内呈剂量依赖性，因此，可以根据CTLL-2细胞生长的程度，对IL-2活性进行定量测定。
CTLL-2(cytotoxic T-lymphocyte line 2)是来源于C57BL/6小鼠的细胞毒T细胞系，对IL-2有依赖的特性，即只能在有IL-2存在的培养基中才能生长，因此可作为指示细胞来测定待检样品中IL-2的水平。除CTLL-2外，丝裂原活化的T淋巴母细胞和小鼠胸腺细胞亦可作为检测IL-2活性的指示细胞。
【材料】
1.检测细胞CTLL-2(一株小鼠来源的IL-2依赖细胞株)。2.待测IL-2样品用PHA刺激的PBMC培养上清液。
3.已知活性为100U/ml的IL-2标准品，10％FCS RPM I 1640。
4.浓度为1mci/ml的3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)。
5.微量细胞收集仪、液体闪烁计数器。
6. PP0(2，5-二苯基恶唑，2，5-diphenyloxazole)、POPOP［1，4双(2’-c5’苯基恶唑)苯，1，4-di-(2’-c5’-phenyloxazolyl)-benzene］、二甲苯。
【方法】
1.制备CTLL-2细胞悬液:收集生长良好的CTLL-2细胞，1500r/min离心5min，用10％FCS RPM I 1640洗涤细胞两次，制成细胞悬液。取一滴用0.5％台酚蓝染色检测细胞活力(应在95％以上)。调整细胞浓度至1×105/ml。
2.加样:将标准品和待测样品分别做倍比稀释。按每孔100μl加入96孔平底培养板中，每个稀释度各加3个复孔。然后，每孔加入CTLL-2细胞悬液100μl。另设3个对照孔，只加100μl细胞和100μl培养液，不加IL-2。加样后，培养板置37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。
3.同位素的掺入及计数:在培养终止前6～10h加入同位素，每孔加入lμci3H-TdR。培养结束后立即用微量细胞收集仪收集细胞。液体闪烁计数测定每管的cpm值。
【结果】
3H-TdR掺入法测得各孔cpm值后，可计算IL-2的活性单位。首先计算出细胞增殖强度R(R为IL-2孔的cpm值)，不同IL-2稀释度时的R值不同。以IL-2稀释度为横坐标，R值为纵坐标，绘制出两者的关系曲线，由曲线查得最大R值。然后找出50％最大R值相应的IL-2稀释度，称为1个IL-2活性单位。
例如: IL-2检测样品的一个活性单位为1∶32，则此样品中含IL-2的浓度为32U/ml。若与已知单位的IL-2标准品比较，即可计算出样品的标准单位。假设IL-2标准品为50μg/ml，在本次试验测得50％最大R值为1∶40;待测样品的50％最大R值为1∶32，则其IL-2的标准单位数(N)可由下式计算:
N= 50μg/ml×(32/40)
【注意事项】
1. CTLL-2在体外长期维持培养比较困难，若条件不具备，可改用ConA激活小鼠胸腺细胞作为检测细胞，方法类似。
2.待测IL-2粗样品中常含低分子量的抑制因子，可经透析后再检测，以提高结果的准确性。
3.检测IL-2活性前需充分洗涤CTLL-2细胞，目的是除去残留的IL-2，以免干扰检测结果。但操作必须轻柔，离心速度不宜过高。
4.加入3 H-TdR的最适时机是阴性对照细胞趋于全部死亡。
5. CTLL-2细胞冻存后复苏较困难，用含丝裂原的培养基长期培养易发生变异。
6.避免同位素污染。
7.加入标准IL-2或待检样品时，按从低浓度到高浓度顺序加入。
【思考题】
1. IL-2主要由何种细胞产生?检测IL-2的活性有何实际意义?
2.为什么说CTLL-2细胞在体外长期维持培养比较困难?
3.简要说明IL-2的诱生过程及其主要生物学作用。
二、MTT比色法
【原理】
白细胞介素-2(Interleukin 2，IL-2)是由Th细胞产生的一种细胞因子，在淋巴细胞增殖分化过程中起着非常重要的作用，而且能维持T细胞在体外长期生长。MTT比色法的原理是以DNA合成酶活性为指标，检测IL-2的活性。CTLL-2是一株IL-2依赖性T淋巴细胞株，只有在IL-2存在的条件下，CTLL-2才能增殖、分裂。细胞增殖活跃时线粒体中琥珀酸脱氢酶活性增加，该酶能使黄色的MTT氧化后形成蓝色结晶状颗粒(formazan)，蓝色颗粒formazan的量与IL-2活性水平成正比，通过比色法可进行定量测定。
MTT比色法具有简单、快速、敏感的特点，在掌握良好的试验条件下，其敏感性可接近3 H-TdR掺入法，且不需要接触同位素。
【材料】
1. PRM I 1640细胞培养液:内含2mol/L谷氨酰胺、25mol/L HEPES、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml及10％灭活小牛血清。
2. PBS-G:含0.5％葡萄糖的磷酸缓冲液(PBS) 0.02mol/L，pH7.2。
3. MTT: 3-［4，5-Dimethythiajol-2yl］-2，5-diphenyltetrajolium bronide，中文名为3-(4’，5’-二甲噻唑-乙基)-2，4-二苯四唑嗅盐，用PBS-G配成1mg/ml使用液，4℃避光。
4. DMSO(二甲基亚砜)。
5. IL-2标准品:活性为500U/ml。
6. CTLL-2:一株来源于小鼠的IL-2依赖细胞株。
【方法】
1.制备CTLL-2细胞悬液:收集生长良好的CTLL-2细胞，用RPM I 1640细胞培养液洗涤细胞两次，1500r/min离心5min。然后制成细胞悬液，用0.5％台酚蓝液染色检测细胞存活率(应在95％以上)，调整细胞浓度至1×105/ml。
2.加样:将标准品及待测样品做倍比稀释，按每孔100μl加入96孔平底细胞培养板中，每个稀释度3个复孔。然后，每孔加CTLL-2细胞悬液100μl。另设3个对照孔，只加100μl细胞和100μl培养液，37℃、5％CO2条件下培养32～40h。轻轻吸弃上清液100μl，加入MTT溶液(1mg/ml) 50μl。于振荡器上振荡1min，放置37℃、5％CO2孵育箱内反应2h。取出培养板，2000r/min离心5min，吸弃上清液，每孔加入DMSO 120μl，振荡30s后，在酶标仪540nm处读取OD值。
【结果】
【注意事项】
1.检测IL-2活性前需充分洗涤CTLL-2细胞，目的是除去残留的IL-2，以免干扰检测结果。但操作必须轻柔，离心速度不宜过高。
2.具体计算方法可参照3 H-TdR掺入法的结果计算举例。
【思考题】
1.试述MTT比色法和3 H-TdR掺入法检测IL-2活性的优缺点。
2. MTT比色法检测IL-2活性的原理是什么?可否把MTT比色法用于淋巴细胞转化试验?
3.检测IL-2的生物活性与采用ELISA法检测血清中IL-2水平的临床意义有何不同?
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