细胞内蛋白质降解的特点

细胞内的折叠或组装出现错误的、变性的、受到损伤的、正常的、外来的蛋白质分子会被迅速降解，这些蛋白质分子的降解可以发生在溶酶体内、内质网腔中或细胞液中。人类细胞中存在两类细胞降解途径，即溶酶体和泛素-蛋白酶体通路，前者无需能量，主要降解细胞外和细胞膜蛋白质；后者则是一种消耗能量的高效、特异的蛋白质降解过程控制着细胞内绝大多数蛋白质的降解。

（一）溶酶体

溶酶体是在1955年由Christian De Duve发现的，是真核细胞的亚细胞结构，为单层膜包被的囊状结构，直径为0．025～0．8μm，内含多种水解酶，可水解蛋白质、多糖、脂类等内源性生物大分子。

除成熟红细胞外，哺乳类动物各种细胞都含有溶酶体。溶酶体内含50余种酸性水解酶，包括蛋白酶、核酸酶、磷酸酶、糖苷酶、脂肪酶磷酸酯酶和硫酸酯酶等。溶酶体的酶有3个特点：①因为溶酶体膜蛋白多为糖蛋白，所以溶酶体膜内表面带负电荷，这样有利于溶酶体总的酶保持游离状态，并能保证其行使正常功能和防止细胞自身被消化；②溶酶体膜内保持低pH状态，有利于保持水解酶活性（溶酶体内pH约5．0，周围胞质pH约7．2），这依赖于溶酶体膜内的转运蛋白，该蛋白可利用ATP水解的能量将胞质中的H＋泵入溶酶体，从而维持溶酶体内低pH状态；③底物只有进入溶酶体才能被水解，不过如果溶酶体膜破损，水解酶逸出，细胞就会自溶。

溶酶体具有多种生理功能，包括原生动物借助溶酶体消化摄入的食物，真核细胞器更新，以及动物发育和变态过程中组织的退化（如蝌蚪尾巴的吸收）等，另外，在白细胞中，溶酶体性质的颗粒还能消灭入侵的微生物。溶酶体内水解酶对机体很多物质的代谢密切相关，如果由于基因缺陷等原因可造成溶酶体内相应水解酶缺乏，其特异底物不能被水解而蓄积在溶酶体，造成细胞代谢障碍，形成溶酶体储（贮）积病。在某些脏器，如果细胞摄入过多或因溶酶体酶活性降低而在细胞内出现大量溶酶体过载，也会引起该病，如Ⅱ型糖原储（贮）积病。溶酶体功能失常还与风湿性关节炎、脑卒中和老年痴呆症有关。

（二）泛素-蛋白酶体在蛋白质降解中的作用

泛素介导的蛋白质降解通路是蛋白质功能的主要调节者和终结者。泛素介导的蛋白质降解这一重大发现最关键的基础是降解本身需要能量。泛素研究的历史可追溯到20世纪40年代，Rudolph Schoenheimer发现蛋白质处于不断地产生和分解的动态平衡中。1953年，Simpson利用放射性核素进行代谢实验，揭示了生物细胞中蛋白质的降解需要ATP水解，但当时认为水解反应是释放能量的反应，他认为ATP释放的能量不可能直接用于蛋白质降解，随后Schneider发现，ATP是维持溶酶体的低pH所必需的，然而选择性抑制溶酶体活性只能抑制由营养缺乏等因素引起的蛋白质降解，而对正常代谢条件下细胞内蛋白质的降解无影响。直至1977年Goldberg通过网织红细胞向红细胞最终分化时，溶酶体消失，细胞内蛋白质仍快速降解，首次证明了蛋白质降解本身是直接需要能量的过程，人类细胞中存在可溶的，直接依赖能量的非溶酶体类蛋白酶。此后，Hershko、Ciechanover和Rose及其他们的同事很快就证明了泛素即为蛋白降解酶的活化因子，提出有关泛素在蛋白质降解中作用的“泛素假说”。1983年，Goldberg证明泛素修饰后的蛋白质降解仍然需要ATP，提出“在蛋白质降解的过程中ATP依赖的二段假说”，他们的研究导致了现在被称为“蛋白酶体”（proteasome）的ATP依赖性蛋白降解酶的发现。现在泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）已成为当今生物医学研究的焦点之一。

1．泛素与泛素化 泛素是含有76个氨基酸残基的低分子量蛋白质（MW 8．6ku，pI 6．7），因其广泛存在于各种真核细胞而得名。泛素的氨基酸序列非常保守，人与酵母的泛素只有3个氨基酸残基的差异，具有很好的热稳定性。X射线衍射分析显示，泛素是一个紧密的球形结构，包括4个β片层和一个α螺旋，形成3个半转角。泛素通常以两种形式存在：一种是游离形式；另一种是通过其C端与受体蛋白赖氨酸侧链的ε-氨基酸基团共价连接。

参与泛素-蛋白酶体通路介导蛋白质降解过程需要3个酶：一是泛素活化酶（ubiqutin-activating enzyme，E1）是催化泛素与蛋白质底物结合所需的第一个酶，能水解ATP，通过其活性位置的半胱氨酸残基在泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素，E1在细胞内含量较丰富，是细胞生存必需的，进化很保守。二是泛素载体蛋白（ubiqutin-carrier protein or ubiqutinconjugating enzyme，E2）是催化泛素与蛋白质底物结合所需的第二个酶，在泛素和底物蛋白之间催化形成异肽键（Iso-piptide）。E2是1985年首先从网织红细胞中分离纯化的，细胞内有多种E2，它们的分子质量差异很大，但介导蛋白质降解的多是小分子E2，真核细胞小分子E2一级结构很保守，都含有一个约160个氨基酸残基组成的高度保守的UBC结构域，此结构域含有其发挥活性必需的半胱氨酸残基，这一半胱氨酸残基在泛素-E2酶硫酯键形成中起作用。三是泛素连接酶（ubiqutin-protein ligase，E3），它是泛素与蛋白质底物结合的第3个酶，在决定泛素介导的蛋白质降解的选择性上具有重要意义，它直接与底物或通过辅助蛋白与底物相互作用。细胞内至少存在几百种E3，各种E3缺乏序列同源性，组成相差很大，有的是单体蛋白，有的是多亚基复合体。目前发现哺乳动物细胞的E3主要有3类：即含HECT（homologous to E6-APC-terminal）结构域的E3、含环指结构（RING finger）的E3和含U-box结构域的E3。

泛素化过程是泛素与蛋白质底物结合的化学过程，由上述3个酶催化完成：①泛素活化酶催化泛素C末端的甘氨酸（Gly），形成Ub-腺苷酸中间产物，然后激活的泛素C端被转移至E1酶内的半胱氨酸（Cys）残基的—SH上。②活化的泛素通过转酰基作用进一步转移到泛素载体蛋白上特异的半胱氨酸残基上，形成E2-Ub硫酯；E2-Ub硫酯提供泛素分子以供泛素C端甘氨酸与底物蛋白的Lys残基的氨基形成共价键，第一个泛素单体是与底物蛋白内部的Lys残基的ε氨基或与底物的α氨基结合，形成异肽链的旁链连接或线性肽键。③泛素可以直接从E2转移给底物蛋白（S）形成Ub-蛋白复合物，或底物蛋白（S）首先与泛素连接酶结合，然后底物蛋白与E2转移的泛素结合。最终Ub-蛋白复合物主要被26S的蛋白酶体识别降解。泛素C末端水解酶可通过水解释放Ub以供再一次循环利用。图7-11示泛素化过程。

泛素蛋白参与许多重要的细胞过程，如蛋白质的转运、降解过程，DNA的修复，细胞分裂、吞噬以及凋亡等过程。泛素通过赖氨酸侧链与目标蛋白形成复合物，而这些泛素分子上暴露的赖氨酸残基则反过来又作为修饰位点，在目标蛋白上形成多个泛素链。泛素化过程中的细胞内信号特异性至少有一部分是由这种泛素链的长度和连接类型决定的。一般认为，由48位或29位赖氨酸连接的4个或更多个泛素链参与26S蛋白酶体途径的蛋白质降解过程，而由63位赖氨酸残基连接的泛素链则不参与蛋白质的降解过程，它主要参与各种下游事件，如DNA修复的后复制过程、信号转导过程、内吞过程以及一些核糖体的功能等。

图7-11　泛素化过程

同时，在泛素化过程中，也有一些在三维结构上与泛素相似的其他调控蛋白，称之为类泛素蛋白，修饰底物发生类泛素化，参与调控一些重要的细胞过程，如以P53等为修饰底物的NEED8／Rub1，与泛素同源性为58%，可发挥正向调控泛素连接酶E3的活性；引导底物蛋白酶体降解等生物学功能。

2．泛素结合蛋白 能够与泛素结合的蛋白质为泛素结合蛋白。目前研究发现主要有八种类型的泛素结合结构域，如UBA、UIM、CUE、GAT、UEV、NZF和PAZ等，长度在20～150个氨基酸之间。泛素结合蛋白通过结合泛素，或传递蛋白质上的泛素化信号，或促进泛素的结合或解聚。这些结构域能够特异性结合单个泛素分子、多聚泛素链或泛素化底物。目前主要通过生物信息学、生物化学、分子生物学和生物物理学等手段，鉴定和分析这些泛素结合结构域。

3．去泛素化 细胞内的许多重要的过程均由靶蛋白泛素化来调控，然而，去泛素化酶催化的去泛素化在调节许多生化途径中也起着重要的作用，如增强许多关键调控蛋白的稳定性。虽然泛素与细胞内许多被快速降解的蛋白质以共价键相结合，但泛素是一种非常稳定的蛋白，这是由于泛素在泛素化蛋白被降解之前，就已被蛋白去泛素化酶水解脱离下来，避免一起被降解，解离下来的泛素可被循环利用。蛋白质去泛素化的重要性还在于一种蛋白质在被确定将被蛋白酶体或溶酶体降解之前，可通过去泛素化避免被不必要地或错误地降解。

4．泛素-蛋白酶体通路 细胞内蛋白质的降解是一个高度复杂、受到严格调控的生命过程，而不能简单地将其视为一个非特异的蛋白质的终结过程，其生物学意义也远比蛋白质合成更为复杂。真核生物中，通过胞吞或胞饮作用进入细胞的细胞外蛋白质和细胞内蛋白质分别由两条不同的途径降解：如凝血因子、免疫球蛋白、白蛋白、载体蛋白、激素等胞外蛋白质被细胞摄入后可形成内体，与溶酶体融合后降解，此溶酶体介导的蛋白质降解是非特异的，针对不同蛋白质的降解速率基本不变；而绝大多数细胞内蛋白质的降解是经泛素-蛋白酶体通路（ubiquintin-proteasome pathway）完成的，该降解途径具有特异性、高效性和不可逆的特点，并受多种调节机制严格调控。经泛素-蛋白酶体途径降解的蛋白质的半衰期可以很长，如细胞骨架蛋白半衰期几天、晶状体蛋白半衰期几年，也可以很短，如p53半衰期仅几分钟。目前发现，许多参与细胞周期、细胞程序性死亡以及感染等重要信号途径的调节蛋白本身均受蛋白酶体降解调控。此外，细胞内新合成的、具有缺陷的蛋白质以及变性蛋白也会被蛋白酶体迅速降解，以防止错误折叠和受损蛋白质在细胞内积聚。在细胞受到外界刺激或者由于自身生长导致细胞的生理状态发生改变时，蛋白酶体介导的迅速且不可逆的特异性蛋白质降解成为细胞打破旧的胞内调节网络秩序，建立新秩序的基础。

蛋白酶体广泛分布于真核细胞的胞核和胞质，负责着细胞内大多数蛋白质的降解，因而调控着几乎所有的细胞活动。它是一种巨大的（约2 000ku）、具有多种蛋白水解酶活性的、主要依赖于泛素的、由几十个亚基组成的、具有四级结构的复合蛋白酶。其空间结构将蛋白质水解活性位点封闭在一个桶形的空腔中，仅通过狭窄的门控通道与外界相连，从而有效阻止正常折叠的蛋白质进入降解腔。26S蛋白酶体由20S核心复合物（core particle，CP）和19S调节复合物（regulatory particle，RP，也称PA700）组成。20S核心复合物约700ku，由4个同轴的、7个亚基组成的七聚体环形垒叠，形成中空的桶状结构。位于桶状结构外侧的两个环（α环）由α亚基（α1～7）组成；位于桶状结构内侧的两个环（β环）由β亚基（β1～7）组成。19S调节复合物是20S核心复合物最主要的激活物，在降解过程中19S调节复合物的功能是：①底物识别；②降解底物去折叠；③释放游离的泛素分子，即去泛素化；④打开α环上的降解腔通道；⑤将去折叠底物送入降解腔。泛素-蛋白酶体介导的蛋白降解途径是：泛素分子在泛素活化酶、泛素载体蛋白和泛素连接酶的顺序催化下交联到特异性降解底物的一个或多个赖氨酸残基上，形成长短不一的Ub链，成为可被蛋白酶体识别的降解信号；泛素化的底物被蛋白酶体19S亚基识别后与蛋白酶体复合物结合；蛋白去折叠后通过α环上的狭窄通道转运至20S蛋白水解腔中降解，同时释放出游离的泛素分子。泛素化酶系和蛋白酶体复合物既可以定位于胞质，也可以定位于胞核，从酵母到哺乳动物细胞，这种严格的泛素化调控机制是高度保守的。