细胞亚群测定

时间：2022-05-13 理论教育版权反馈

【摘要】：T淋巴细胞依据其表面标志分子可分成若干亚群，当T淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱，并发生一系列病理变化。研究表明，T淋巴细胞亚群在患多种疾病时都有异常改变。因此T淋巴细胞亚群的检测，已成为临床检验的一项重要指标。目前常用的检测人T淋巴细胞亚群的方法有以下几类。分别加T淋巴细胞亚群单克隆抗体抗CD3、抗CD4、抗CD8各10～15μL，置于湿盒内30min，用PBS洗三次，吹干。

实验二　T细胞亚群测定

T淋巴细胞依据其表面标志分子可分成若干亚群，当T淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱，并发生一系列病理变化。研究表明，T淋巴细胞亚群在患多种疾病（如自身免疫性疾病、免疫缺陷性疾病、变态反应性疾病、再生障碍性贫血、病毒感染、恶性肿瘤等）时都有异常改变。因此T淋巴细胞亚群的检测，已成为临床检验的一项重要指标。

目前常用的检测人T淋巴细胞亚群的方法有以下几类。①免疫荧光法；②生物素－亲和素－辣根过氧化物酶复合物（ABC）法；③免疫酶标法，包括过氧化物酶－抗过氧化物酶（PAP）法、碱性磷酸酶－抗碱性磷酸酶（APAAP）桥联酶标法；④免疫金银法（IGSS）。本实验仅介绍APAAP桥联酶标法。该实验具有灵敏度高、无内源性酶干扰、易于计数等优点。

一、APAAP桥联酶标法

实验目的

了解用APAAP桥联酶标法检测T淋巴细胞亚群的原理和操作过程。

实验原理

APAAP桥联酶标法是近年来发展起来的一种实用免疫组化技术，适用于各种组织切片。该方法涉及三种抗体。第一抗体，为鼠抗人细胞表面抗原CD3、CD4、CD8的单克隆抗体；第二抗体，为羊抗鼠Ig抗血清；第三抗体，为鼠抗碱性磷酸酶单抗与碱性磷酸酶结合的复合物。其原理和PAP方法的类似，属于非标记抗体的桥联酶标方法，即第一抗体与待测的抗原结合，第二抗体起桥联作用，其第一个Fab段连接第一抗体，另一个Fab段连接酶联第三抗体，再通过第三抗体中的碱性磷酸酶催化底物萘基酰磷酸生成萘酚，萘酚再与坚固红偶联，生成一种光镜下可见的玫瑰红色沉淀物，依此可鉴定相应的抗原物质。

实验材料

（1）T淋巴细胞亚群检测APAAP试剂盒。

（2）0．01mol/L的PBS（pH值为7．2）。

（3）肝素－Hanks液、小牛血清、淋巴细胞分离液、Hanks液。

（4）其他：无菌注射器、吸管、试管、玻片、盖片、普通显微镜、水平离心机等。

实验方法

1．标本的制备

涂片要用清洁玻片，最好是用酸处理过的，然后经水洗后放在95%乙醇中保存，临用前从乙醇中取出，用干净纱布擦干净，涂片前用棉签取黏片剂，均匀涂在干净玻片上，干后制备细胞涂片，有利于细胞黏附。

（1）全血和骨髓涂片按常规方法推片，在空气中干燥2h以上，涂片不应太厚，厚血片在染色过程中易脱落。

（2）单个核细胞涂片的制备方法：取抗凝血1～2mL，常规分离单个核细胞，离心后将含有沉淀细胞的试管倒置，尽量去除上清液，加2滴小牛血清，将沉淀细胞混匀成悬液，取细胞悬液滴于涂有一层黏片剂的玻片上，然后再吸取液滴，剩一薄层细胞，快速吹干。

2．标本的保存

标本如不进行染色，干燥后用铝箔或塑料纸包起来密闭防潮，最好放干燥器中，放于－20℃冰箱内可保存半年至一年，而抗原性不会丢失，标本在室温下仅可保存3～5d，长期保存会因抗原变性而不能染色。

3．标本的染色

（1）细胞涂片标本，室温干燥2h以上或过夜，用纯丙酮固定3～5min，待丙酮挥发后，用特制画油在标本外周画圈，以防止抗体溢出。如用戊二醛固定液固定，可以先用画油在标本外画圈，然后滴加固定液于标本上，固定1～2min。再用PBS洗后，经冷风快速吹干。

（2）分别加T淋巴细胞亚群单克隆抗体抗CD3、抗CD4、抗CD8各10～15μL，置于湿盒内30min，用PBS洗三次，吹干。

（3）加羊抗鼠IgG二抗，每孔10～15μL，于室温下放置30min，用PBS洗三次，冷风吹干。

（4）加APAAP复合物三抗，每孔10～15μL，于室温下放置30min，用PBS洗三次，冷风吹干。

（5）加碱性磷酸酶底物显色：临用前取底物液按每毫升底物液加1mg坚固红的比例加入坚固红，充分混匀。取20～40μL加于标本上，于室温或37℃温箱显色5～30min，在低倍镜下观察，可见到细胞膜上出现红色标记物，待显色效果很明显时，用自来水冲洗终止显色。以上每步均需将标本放于湿盒内，以防止液体蒸发。

（6）加苏木素复染液一滴，复染1～2min，用自来水轻轻冲洗。

（7）用甘油明胶封片，如标本需要长期保存，可将封片剂瓶放在热水中，然后加一滴封片剂于标本上或加于盖片上封片，镜检。如果不需保存，可加1滴水于标本上，加盖片后观察，标本干燥后细胞形态不易观察。

实验结果

于高倍镜下观察，细胞核呈蓝色，细胞表面有红色标记物的细胞为阳性细胞，无红色标记物的细胞为阴性细胞，计数100～200个单个核细胞，计算阳性细胞百分率。

正常参考值：正常人外周血中，CD3阳性细胞的比例一般在60%～80%，CD4阳性细胞的比例一般在35%～55%，CD8阳性细胞的比例一般在20%～30%，CD4/CD8比值在1．5～2．0。

注意事项

（1）分离淋巴细胞时每步操作均应轻柔，避免细胞表面抗原丢失。

（2）加各种抗体时，各种抗体之间不要相混。

（3）底物显色液应临用前配制。

思考题

目前常用于鉴定T淋巴细胞亚群的免疫酶染色技术有哪些？

二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群

实验目的

了解用流式细胞仪技术检测T淋巴细胞亚群的原理和操作过程。

实验原理

流式细胞仪（FCM）又名荧光激活细胞分类仪（FACS），是集现代电子物理技术、激光技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术于一体的先进科学仪器，具有对细胞分析和分选的功能。将待测样品制成单细胞悬液，经荧光色素染色后，在气体压力的推动下进入充满鞘液的流动室，在鞘液的约束下细胞排成单列从直径为50～100μm的喷嘴中逐个高速喷出，并被鞘液包绕形成细胞液柱。当细胞通过激光束检测区时，细胞被激光束照射而发出荧光和散射光，这些光信号被光敏元件接收后转换成电信号，经计算机分析和处理可得到细胞的多种信息参数。

实验材料

（1）采血用注射器，含抗凝剂试管，流式试管（兼作染色和测定用）。

（2）移液器（10～20μL，100μL和1mL），移液器头，离心机，水浴箱。

（3）溶血剂，缓冲液（洗涤用），固定剂（1%PFA）。

（4）荧光抗体：①同型对照抗体（mouse IgG1－FITC/IgG2b－PE）；②CD3－FITC；③CD3－PE；④CD8－PE；⑤CD3－FITC/CD19－PE（双标记混合荧光抗体）；⑥CD3－FITC/CD16＋56－PE（双标记混合荧光抗体）。

（5）FACS Aria（BD公司）。

实验方法

（1）采静脉血1mL于肝素抗凝管中。

（2）取7支流式测定试管，编号（1～7），按照表6－1内容先加荧光抗体。

表6－1　检测内容及需加的相应抗体及其量