一、目的要求
1．掌握超声波破碎细胞的原理和操作。
2．学习细胞破碎率的评价方法。
二、实验原理
频率超过15～20 k Hz的超声波，在较高输入功率下（100～250 W）可破碎细胞。本实验采用JY95-2D超声波细胞破碎机，超声波细胞破碎机由超声波发生器和换能器两部分组成。其工作原理：超声波发生器将220 W、50 Hz的单相电通过变频器件变为20～25 Hz的交变电能，并用适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械运动，振动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。
三、仪器与试剂
1．仪器
超声波细胞破碎机（图1-4-1）、电子显微镜、紫外—可见分光光度计、酒精灯、载玻片、血细胞计数板、接种针等。
2．试剂
马铃薯培养基（p H6.5）。
图1-4-1 超声波细胞破碎机
四、实验操作与步骤
1．培养基的配制和灭菌
选取优质马铃薯去皮切块200 g，加水1 000 m L煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加蔗糖20 g及琼脂20 g，融化后补充加水至1 000 m L（p H6.5），分装，120℃灭菌20 min。
2．啤酒酵母的培养
（1）菌种纯化。将酵母菌种转接至斜面培养基上，28℃～30℃，培养3～4 d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至50 m L液体培养基中，28℃～30℃培养24 h。
（2）扩大培养。将培养成熟的5 m L液体培养基中的酵母菌全部转接至50 m L液体培养基的锥形瓶中，28℃～30℃培养15～20 h。
3．细胞破碎操作
（1）破碎前计数。取 1 m L 酵母细胞悬液适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数。
（2）超声波细胞破碎。
① 将50 m L酵母细胞悬液放入100 m L容器中，液体浸没超声发射器2 cm。
② 打开开关，将频率设置中挡，超声破碎1 min，间歇1 min破碎20次。
③ 取1 m L破碎后的细胞悬液经适当稀释后，滴一滴在血细胞计数板上，盖上盖玻片，用电子显微镜进行观察，计数。计算细胞破碎率。
④ 破碎后的细胞悬液，于12 000 r/min、4℃下离心30 min，去除细胞碎片。用考马斯亮蓝法检测上清液中蛋白质的含量。
五、实验说明
（1）用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。
（2）用两种方法对细胞破碎率进行评价：一种是直接计数法，对破碎后的样品进行适当稀释后，通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞计数，从而算出结果；另一种是间接测定法，将破碎后的细胞悬液离心分离掉固体，然后用考马斯亮蓝法检测上清液中蛋白质含量，也可以评估细胞的破碎程度。
六、思考题
1．细胞破碎的影响因素有哪些？
2．直接计数法与间接测定法的优缺点各有哪些？
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