细胞色素酶简介

细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）超家族是最重要的药物代谢酶，约90%的药物由这一类酶参与代谢，在人体中主要存在于肝脏与肠壁中，同时它也广泛存在于动物、植物、真菌和细菌等各类生物体中，其编码的酶系主要参与生物体内各种内、外源性物质代谢，发挥着许多重要的功能。它们最初由Garfinkel和Klingenberg在1958年从哺乳动物的肝脏微粒体中发现，由于此类蛋白在还原状态下能与CO结合，结合后可以在波长为450nm处检测到明显吸收峰，因此被命名为细胞色素P450酶。

8.1.1 细胞色素P450酶的研究历史

距离人类首次从小鼠肝脏微粒体中检测到细胞色素P450酶的存在已有近60年的历史，其中20世纪50—60年代是细胞色素P450酶研究最活跃的时期。基于这段时期取得的研究结果，人们逐渐了解到细胞色素P450酶是维持生物体内平衡的主要功能执行者，主要通过催化体内的单加氧反应来实现其生理功能。

对于整个细胞色素P450酶体系的研究可追溯到20世纪40年代末期Millers和他的同事对于奶油黄（对二甲氨基偶氮苯）的代谢及其与受体蛋白结合后导致肿瘤的研究。并且在1949年和1956年的两篇论文中，他们主要强调了NADPH、分子氧及存在肝脏特定部位的细胞器在氨基偶氮类染料代谢中的重要性。与此同时，Axelrod在研究药物代谢过程时发现肝脏微粒体是药物代谢反应进行的主要场所，并且在药物的代谢过程中需要NADPH和分子氧的参与。这些早期对于药物代谢的研究结果对以后确定细胞色素P450酶是肝脏微粒体中主要的药物代谢酶奠定了基础。此外，在研究类固醇激素代谢的过程中，Ryan和Engel认为与药物代谢类似前列腺素的C 21羟基化反应也主要发生在肾上腺皮质内的微粒体中，并且需用分子氧的参与。尽管当时的这些研究结果未能与细胞色素P450酶的功能相联系，但极大地促进了此后对于细胞色素P450酶的功能研究。

除了相关的基础研究外，一些新技术的产生在细胞色素P450酶的发现过程中也起了非常重要的作用。特别是可以应用到细胞呼吸及氧代谢研究中的三种实验技术，在很大程度上促进了细胞色素P450酶的发现以及对功能的认识。第一项实验方法是通过氧元素的重同位素（18O2）质谱方法研究氧代谢过程，证明了在金属蛋白酶催化下分子氧可以结合到无机底物分子中，使人们对氧化反应有了更加深入的了解。其次，可用于线粒体或微粒体中呼吸色素研究的光谱敏感双束快速扫描机的应用，极大促进了对于细胞色素P450酶的鉴定。由于这种方法消除了在光谱分析中添加去垢剂来纯化样品的流程，从而保证存在于微粒体提取样品中的细胞色素P450酶的完整性。最后一项方法是氧电极方法，这种简单的极谱法可以准确地测量细胞色素P450酶催化反应中分子氧的利用率。

依靠上面这些新技术方法，1958年德国科学家Martin Klingenberg在研究细胞色素b5还原酶时，意外发现了与CO相结合后的天然色素在波长为450nm处的具有一个大且宽的吸收带。当时以天然色素（pigment）的第一个字母P及测定的波长450nm命名该物质为P450。此外，Klingenberg的研究也表明P450是肝脏微粒体中一类高浓度的未知电子受体，它接受电子的能力大约是细胞色素b5还原酶的两倍。之后在不同组织都鉴定到了P450的存在，例如微粒体和肾上腺组织中。虽然当时已经在实验中鉴定到了这一类新蛋白酶的存在，但对于它的功能却没有实质性的研究。直到1962年，两位日本科学家Ryo Sato和Tsuneo Omura证实由Klingenberg发现存在于肝脏微粒体中能与CO结合的P450属于血红素蛋白，同时正式命名为细胞色素酶（cytochrome）。与此同时，另一项研究发现位于肝脏内质网的药物代谢酶可以随着肝脏微粒体中细胞色素酶的浓度增加而被诱导，从而在药物代谢和细胞色素P450酶功能之间建立了联系。1965年Cooper等利用实验方法证实了细胞色素P450酶同时也是类固醇激素代谢过程中的末端氧化酶和微粒体中脂肪酸羟基化酶。这些研究发现对于早期细胞色素P450酶功能的研究起了非常重要的补充和推动作用。

在对于细胞色素P450酶的特点和功能有一定了解之后，人们的研究逐渐深入到对于此类蛋白酶参与的氧化反应机制和反应过程中所必需的电子传递体中。尽管最初人们对NADPH还原酶的研究都集中在细胞色素C氧化酶，但随着研究的深入及人们对于细胞色素P450酶介导的催化机制的了解，NADPH还原酶被认为是在细胞色素P450酶催化反应中主要的电子传递体。此外，黄素蛋白还原酶也被认为是细胞色素P450酶催化反应的主要电子传递体。基于以上的研究结果，细胞色素P450酶催化的基本反应底物羟基化的作用机制被提出，标志着细胞色素P450酶的研究进入了一个新的阶段。

到了20世纪70年代末80年代初时，基于细胞色素P450酶个体的研究开始发展起来。表现为对不同细胞色素P450酶个体基因、c DNA克隆和蛋白表达的调节等。截至1987年底，距第一个哺乳类细胞色素P450酶的DNA序列被测定后的5年内，至少有65个细胞色素P450酶的单体被测序和克隆。当时，利用细菌载体来表达细胞色素P450酶已经成为最广泛使用的技术方法。此外，Larson发现细胞色素P450酶的氨基末端与整个酶的活性无关，这意味着对于该末端片段进行删除或修饰将不会对细胞色素P450酶的活性产生影响。而对于氨基末端进行必要的改造后，将可以得到具有活性的细胞色素P450酶晶体，从而获得细胞色素P450酶的三维结构信息。目前，已有许多重要的细胞色素P450酶的结构被测定，使得人们对于细胞色素P450酶的认识从序列水平扩展到蛋白结构层面。

尽管细胞色素P450酶的研究仅有半个多世纪的历史，但对于这个至关重要的酶家族却已经有了很深程度的了解，相信随着实验技术方法的改善以及基于高效能计算方法的引入，将会有更加深入的探索。

8.1.2 细胞色素P450酶的分类

细胞色素P450酶家族广泛存在于细菌、真菌、植物、动物等各种生物当中。截至2009年，已经发现的细胞色素P450酶多达11512种。为了能够更加系统、方便地描述这个大家族中包含的各个蛋白，Nebert等提出了以氨基酸序列的相似性为标准来命名不同单体的方法，并且得到同行们的认可，目前这种命名细胞色素P450酶的方法仍然被沿用。根据命名规则，如果两个细胞色素P450酶蛋白的氨基酸序列的相似性＞40%，则属于同一家族，即用阿拉伯数字命名，如CYP1、CYP2、CYP3、CYP4等；如在同一家族内的两个细胞色素P450酶蛋白的氨基酸序列的相似性＞55%，则被划到同一亚家族，即用阿拉伯数字后加一个英文字母来表示，如CYP1A、CYP2C、CYP2E、CYP3A等；最后在英文字母后再加一个阿拉伯数字来表示不同的细胞色素P450酶蛋白，如CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7等。如果进一步要考虑到基因变异信息，则如果两个细胞色素P450酶蛋白的氨基酸序列相似性＞97%，则其中一个细胞色素P450酶被看成另一个酶的等位变异体。同一家族的酶具有相似的功能，如CYP4A催化脂肪酸和ω羟化反应。目前已知哺乳动物体内有14个细胞色素P450家族，即CYP1、2、3、4、5、7、8、11、19、21、24、27、51等，而CYP2、4、51的部分亚家族成员不专属于哺乳动物；其中有30多个家族成员存在于人体内，主要分布在肝脏。

P450是代谢外来物的主要酶系。在人体中已经鉴别出至少12种细胞色素P450亚型，其中有3种酶系作用最强：P4501、2和3系，即CYP1、CYP2和CYP3系。P450酶系由三部分组成：血红素蛋白（P450）、黄素蛋白（NADPH 细胞色素C还原酶）和磷脂（磷脂酰胆碱）。P450系统组成复杂，由基因多样性控制，称作P450基因超家族。许多P450具有遗传多态性，是引起个体间和种族间对同一底物代谢能力不同的原因之一。

截至2006年7月，已发布7n个家族1677个亚家族，共6051条单一细胞色素P450基因，其中动物2279条、植物1932条、细菌621条、真菌1001条、原生物210条、古生菌8条。人细胞色素P450基因有14个家族26个亚家族。其中参与药物、致癌物、类固醇激素和脂肪酸等外源物质代谢的细胞色素P450在体外药物代谢研究中最为重要，包括CYP1、CYP2、CYP3、CYP4、CYP17、CYP19和CYP2I等多个CYP家族。估算认为，约有60%的处方药是经过CYP代谢。涉及大多数药物代谢的酶系主要有CYPI、CYP2和CYP3三大家族。

8.1.3 细胞色素P450酶的功能

细胞色素P450是P450酶系的末端氧化酶，决定底物和产物的特异性，是酶系的关键组分。以铁原卟啉为辅基，是一种单链的b组细胞色素蛋白，具有血色素类似的结构。细胞色素P450以膜结合和可溶性两种形态存在于生物体内。主要分布于内质网、微粒体、线粒体上，也有的分布于液泡膜和质膜上。细胞色素P450对许多内源性和外源性的化学物质，尤其对环境有害化学物质存在氧化代谢作用，使化学物质的活性或者毒性、药物的药效发生变化。其种类、催化反应类型的多样性及底物的广谱性使其成为自然界中最具催化多样性的生物催化剂。在动物中， P450主要参与大部分药物和杀虫剂等外源物的生物氧化作用，以及固醇类的生物合成、脂肪酸和类固醇激素等内源性底物的氧化代谢作用。它使进入机体的外源物经代谢后向两个方向发展：代谢解毒和代谢活化；代谢活化后的产物有较强的毒性，甚至产生致畸、致癌效应。

细胞色素P450酶的主要功能大致可以分成三方面：体内激素物质的合成、外源物质代谢及脂肪酸分解。

在很多含有CYP450的生物体系中都具有CYP51单体，它主要负责合成细胞膜和激素所需要的类固醇物质。在脊椎动物中，合成性激素必需的胆固醇首先是由分布在线粒体和内质网之间的CYP11A、CYP17A和CYP19A三个亚家族合成，然后再由分布在内质网中的CYP2A、CYP2B、CYP2C和CYP3A亚家族进行修饰，最终合成睾酮和雌激素。而在植物中，与脊椎动物的类固醇激素相当的是植物类固醇激素。这一类激素也是由胆固醇通过多种细胞色素P450酶催化合成，其中CYP85A、CYP90A、CYP90B、CYP90C和CYP90D几个亚家族被证实主要参与植物类固醇激素的合成。此外，在昆虫体内的蜕化素也是一种类固醇激素，它也是由CYP302A、CYP306A、CYP307A、CYP314A和CYP315A参与合成。细胞色素P450酶除了参与合成类固醇激素外，所介导的反应也可以导致这些激素失活。例如在脊椎动物体内的CYP3A可以调节睾酮激素的6β、16β及11β反应引起激素的功能降低；同样，CYP73A1和CYP72C也可以催化植物内的植物类固醇激素羟基化和昆虫内蜕化素失活的26羟基化反应。

细胞色素P450酶介导的外源物质代谢在不同生物系统中表现为不同的形式。例如：在人体内主要表现为细胞色素P450酶的前三个家族CYP1、CYP2和CYP3参与进入人体的化学物质代谢，特别是对药物的氧化代谢；而在其他脊椎动物和昆虫体内表现为对植物毒素的代谢。同时对于同一类化学物质的代谢，在不同生物体将由不同家族的细胞色素P450酶参与完成。例如：对于呋喃香豆素分子，尽管细胞色素P450酶代谢涉及的区域主要针对该化合物结构的呋喃环和甲基，但在人体中主要由CYP3A4催化完成，而在昆中体内由CYP6B和CYP321A1介导完成。此外，由于不同细胞色素P450酶的活性中心的大小不同，具有较小活性中心的细胞色素酶，如人体的CYP2A6，与呋喃香豆素结合后，由于该化合物不能被正常代谢，还可以导致对其他化合物代谢能力的下降。

与前两项功能相似，负责脂肪酸分解特别是对脂肪酸的羟基化反应，在不同生物体内也是由不同家族的细胞色素P450酶催化。有一些细胞色素P450酶会催化脂肪酸末端甲基进行羟基化，这些酶的活性相当于ϖ 脂肪酸羟基化酶；而另外一些细胞色素P450酶催化脂肪酸内部的碳原子进行羟基化，相当于链内脂肪酸羟基化酶。目前普遍认为不同家族的细胞色素P450酶对于脂肪酸链长度和饱和性有着不同的选择性。例如：在细菌中，CYP102A1可以催化脂肪酸的C12到C18碳原子的羟基化。与CYP102A1相同家族的CYP102A2和CYP102A3也显现了与CYP102A1相近的脂肪酸链长度的选择性；而CYP52A亚家族主要催化脂肪酸C12～C16位的羟基化。在植物中的细胞色素P450酶显示了更加多样的羟基化酶活性，包括ϖ羟基化酶、链内羟基化酶和中长链脂肪酸的环羟基化酶等。这些细胞色素P450酶主要有CYP81B、CYP86A、CYP94A及最新鉴定出的CYP76A和CYP709C家族等。而在动物体内，参与脂肪酸羟基化反应的细胞色素P450酶主要是CYP4A亚家族。与其他生物体内存在具有脂肪酸羟基化活性的细胞色素P450酶相比，CYP4A亚家族的酶蛋白有着更高的特异性，这可能是由于在4A亚家族蛋白中，重要功能的辅基血红素基团与蛋白Ⅰ 螺旋主链上的原子共价结合有关。

在人体中，由细胞色素P450酶系催化的药物生物转化是药物代谢中最重要的一个系统。通常代谢物比母体药物活性低，但代谢活化后的产物有较强的毒性，甚至产生致畸、致癌效应。该系统被多种机制诱导或者抑制，具有显著的个体差异。因此，鉴定更多由P450催化代谢的药物、对其基因表达与调控进行分子机制的研究、阐明酶个体差异和种族差异的机制，将为临床合理用药提供科学依据，从而真正做到用药剂量个体化，以提高疗效，减少不良反应。药物在体内代谢包括两相反应：Ⅰ相反应是氧化还原或水解反应，主要涉及细胞色素P450家族；n相反应是结合反应，涉及谷胱甘肽、葡萄糖醛酸、硫酸盐和甘氨酸等。通常情况下，一种药物要经过多种亚型的细胞色素P450代谢，仅少数药物经单一的药酶代谢。估算认为，约有90%的处方药是经过细胞色素P450代谢。现已经确定的细胞色素P450家族为1个家族42个亚族。参与代谢的细胞色素P450主要是CYP3A4、CYP-IAZ、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D65种，占细胞色素P450的95%。约有55%的药物经CYP3A4代谢，20%经CYP2D6代谢，15%经CYP2C9和CYP2C19代谢。药物代谢反应中，由细胞色素P450催化的Ⅰ相反应是药物在体内代谢的关键步骤，因为这一步反应常常是药物从体内消除的限速步骤，可影响药物的生物利用度，同时，在体内的药物动力学个体差异往往是由于参与代谢的细胞色素P450活性存在较大个体差异所致。因此，对细胞色素P450酶学性质的研究包括对酶本身的性质以及与之结合的配基的化学性质的研究，已经成为药物体外代谢研究的核心。

8.1.4 细胞色素P450酶的多样性

在不同的生物体内，细胞色素P450酶（P450）表现出多样性。随着对于所有古生菌、一些细菌、真菌和高级真核生物的基因测序的完成，人们对于这些生物体内的细胞色素P450酶也有了深入的了解。确定了在每个生物体内，存在细胞色素P450酶的数量大不相同。例如：在一些种属的细菌内只能检测一个细胞色素P450酶的存在，而在链霉菌属中有18～33不等的细胞色素P450酶，在分枝杆菌属中可检测20～40个细胞色素P450酶。在真核生物体内，细胞色素P450酶的数量进一步增加。如在莱茵衣藻（chlamydomonas reinhardtii）基因组中存在34个细胞色素P450酶，在蜜蜂（apismellifera）基因中有46个细胞色素P450酶被检测到，57个细胞色素P450酶在人基因组中，71个细胞色素P450酶在苔藓（phy-sco mitrellapatens）基因组，83个细胞色素P450酶在果蝇（drosophila melano-gaster）基因组，100个细胞色素P450酶在蚊子（anophelesga mbiae）基因组，80个细胞色素P450酶在线虫（caenorhab ditiselegans）基因组，在拟南芥基因组中发现的细胞色素P450酶有246个，在水稻基因组中是356个。由以上不同生物体内的细胞色素P450酶的数目直接反映了该细胞色素P450酶的多样性。

自从1987年第一个来自于恶臭假单胞菌（pseudom on asputide）的细胞色素P450酶（P450cam）的三维结构被测定之后，陆续有不同细菌、植物和哺乳动物的细胞色素P450酶的三维结构被成功测定。截至2010年，共有50多种细胞色素P450酶的结构在PDB数据库中可以检索到（见表8-1）。

表8-1 截至2010年，PDB数据库能够检索到的CYP信息

（续表）

除了在不同生物体内细胞色素P450酶的数量不同外，不同家族中的细胞色素P450酶个数在不同生物体也各不相同。对于只有植物所特有的CYP71家族，在拟南芥中有52个细胞色素P450酶个体，而在水稻中有90个。此外，对于昆中和动物特有的CYP4家族中，在蜜蜂中有4个酶单体，在人类中有11个，在蚊子中却有45个单体。但是对于参与类固醇激素合成的CYP51家族，不论在真菌还是在植物、动物体内，该家族的成员都非常保守。

尽管不同家族的细胞色素P450酶在序列水平上差异较大，但从总的结构来看却显示出了一定的保守性。例如所有测定的细胞色素P450酶通常由11个α螺旋（A～K）和4个β折叠（1～4）构成，并且采取相似的折叠形式构成三级结构。同时发挥重要功能的亚铁血红素基团位于螺旋I和邻近螺旋L之间的一个疏水环境的一个口袋里，与位于催化中心的半胱氨酸和蛋白至少一个碱性氨基形成氢键。此外，由于催化中心的半胱氨酸及周围蛋白环境对于细胞色素P450酶发挥功能具有重要作用，这个绝对保守的半胱氨酸与催化活性中心亚铁血红素中的铁原子可以形成硫醇盐离子键，因此，半胱氨酸所在的区域在不同种属的细胞色素P450酶三维结构之间显示了一定程度的保守性。

虽然所有细胞色素P450酶的蛋白结构都具有上面所描述的保守性，但在局部区域上仍然有一些结构多样性。如：二级结构元件在整个空间结构的位置、连接两个二级结构部分之间的环区域大小等。这些局部区域上的结构多样性导致不同细胞色素P450酶具有不同大小和形状的活性中心，从而保证不同化合物能与相应的细胞色素P450酶结合而代谢。其中B螺旋、FG区和底物结合 4区是细胞色素P450酶结构中变化程度最大的区域，这些区域也是决定细胞色素P450底物特异性的关键区域。例如，对于小鼠体内的CYP2A4和CYP2A5两种属于同一亚家族的细胞色素P450酶，由于在以上区域中存在几个氨基酸的差别，就可以导致其中一种酶主要代谢睾丸激素，而另外一种酶主要参与香豆素的羟基化反应。另外一个显著的例子来自相近种属spearmint中的CYP71D15和peppermint中的CYP71D18，它们之间虽然只有一个残基的差别，但却催化柠檬烯在C6和C3两个不同位点的羟基化反应。其他的研究也证实：在脊椎动物和植物中，如果将氨基酸进行突变完全可以导致细胞色素P450酶的底物特异性发生相应改变。