细胞自然杀伤活性的测定

实验七　NK细胞自然杀伤活性的测定

实验目的

了解测定NK细胞自然杀伤活性的原理和操作过程。

实验原理

NK细胞具有自然杀伤肿瘤细胞的活性，检测人NK细胞杀伤活性常用的敏感靶细胞为K562细胞。NK细胞通过与靶细胞的直接接触而杀死靶细胞，噻唑蓝（MTT）是水溶性浅黄色物质，经活细胞内线粒体代谢而生成蓝紫色的甲臢结晶，沉积于细胞内和细胞周围。在一定条件下甲臢生成量与活细胞的数量成正比。通过测定OD值，可反映NK细胞对靶细胞的细胞毒性活性。

实验材料

（1）淋巴细胞分离液。

（2）K562细胞株：NK细胞敏感的靶细胞株，选取处于对数生长期的体外连续传代细胞。

（3）5g/L MTT溶液：用0．01mol/L磷酸缓冲液（pH值为7．4）配制，过滤除菌，于－20℃处保存。

（4）10%SDS－50%二甲基甲酰胺：将10g SDS放入100mL 50%二甲基甲酰胺中加热溶解。

（5）酶标仪、96孔细胞培养板、微量加样器等。

实验方法

（1）NK细胞的制备：利用淋巴细胞分离液从人肝素抗凝血中分离出单个核细胞。经RPMI－1640细胞培养液洗涤3次，置于细胞培养瓶中于室温孵育1h，以去除单核细胞，然后调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，备用。

（2）靶细胞的制备：取对数生长期的K562细胞，经细胞培养液洗涤3次，调整细胞浓度为2×10⁵个/mL。

（3）细胞毒实验：取上述效应细胞和靶细胞悬液各50μL，加到96孔细胞培养板内混匀，同时设单独效应细胞对照孔和单独靶细胞对照孔，每个样本做3个复孔。于37℃、5%CO₂饱和湿度条件下孵育4h，加入MTT溶液，每孔10μL。继续孵育4h，加10% SDS－50%二甲基甲酰胺100μL，置于37℃环境中14～18h后，待其充分溶解后，在酶标仪上于570～630nm处测定光密度值OD。

实验结果

按下列公式计算NK细胞的细胞毒活性。

注：OD_E表示效应细胞孔OD_570～630nm；OD_T表示靶细胞孔OD_570～630nm；OD（E＋T）表示效靶混合孔OD_570～630nm。

注意事项

（1）加入10%SDS－50%二甲基甲酰胺后，放温箱内14～18h，待其完全溶解后再测定。

（2）每次最好取2～3个效靶比例，范围一般在（10～50）∶1。

（3）混合前效应细胞与靶细胞的存活力均应大于90%，否则过多的死细胞影响结果。

思考题

检测NK细胞功能的方法还有哪些？各有什么特点？