酶法测定血清中游离脂肪酸

实验十五　酶法测定血清中游离脂肪酸

【实验目的】

了解和掌握酶法测定血清中游离脂肪酸的原理和操作步骤。

【实验原理】

临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)或非酯化脂肪酸(nonesterifiedfatty acid，NFFA)，正常血清中含有油酸(18∶1)、软脂酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，另外还有少量的月桂酸(12∶0)、肉豆蔻酸(14∶0)和花生四烯酸(20∶4)等。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平易受脂代谢、糖代谢和内分泌机能等因素的影响，血中NFFA半衰期为1～2分钟。血清中的NFFA与清蛋白结合成一种简单的脂蛋白进行运输。

测定血清NFFA的方法有滴定法、比色法、原子分光光度法、高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。制作NFFA测定的标本时一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易快速使血中TG和PL酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。储存标本仅限于24小时内，若保存3天，其值约升高30%，导致结果不准确。

酶法测定游离脂肪酸的原理:血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸(NEFA)，经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NFFA含量成正比。

【实验材料】

人血清。

【实验器材】

试管、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、分光光度计等。

【药品试剂】

1．缓冲液:0．04 mmol/L pH6．9磷酸缓冲液，3 mol/L MgCl₂，0．15%去垢剂。

2．酶/辅酶:乙酰CoA合成酶≥0．3 U/ml，抗坏血酸氧化酶≥1．5 U/ml，CoA0．9 mmol/L，ATP 5 mmol/L，4-AAP1．5 mmol/L，溶于10 ml上述缓冲液中。冷藏5日内使用。

3．酶稀释液:苯氧乙醇0．3%(V/V)。

4．马来酰亚胺混合液:马来酰亚胺10．6 mmol/L，与酶稀释液等体积混合。

5．酶试剂:乙酰CoA氧化酶≥10 U/ml，过氧化物酶7．5 U/ml，TOOS 0．2 mmol/L，混合上述试剂，再与等体积马来酰亚胺混合液混合。冷藏5日内使用。

6．1 mmol/L游离脂肪酸标准液:冷藏。

【实验方法】

1．抽提:准备四支试管，分别标记为试剂空白管、标准管和测定管以及测定空白管。在试剂空白管中加入25μl水和0．5 ml酶/辅酶;在标准管中加入25μl 1 mmol/L游离脂肪酸标准液和0．5 ml酶/辅酶;在测定管中加入25μl和0．5 ml酶/辅酶;在测定空白管中加入0．5ml酶/辅酶。混匀后在37℃水浴10分钟。

2．显色:分别向四支试管中加入1 ml酶试剂，同时在测定空白管中加入25μl血清，混匀后，在37℃水浴10分钟。

3．测定:以空白管调节零点，在550nm波长下测定各管的吸收值，分别记录为标准管(T)，测定管(A)和测定空白管(BT)。

4．计算:

【思考题】

简述酶法测定血清中游离脂肪酸的原理。