肌酐(creatinine,Cr)是肌肉中磷酸肌酸代谢的终产物,由肾排出。它从肾小球滤过后不被肾小管重吸收,故每日尿肌酐的排泌量基本上等于其生成量,肌酐的排出量较恒定。因此,测定血及尿中肌酐的含量更能反映肾的排泄功能。
血清肌酐测定方法主要有碱性苦味酸(Jaffe法)、酶偶联法、高效液相色谱法等。
(一)碱性苦味酸比色法
【原理】 血浆或血清样本经除蛋白处理后,肌酐与碱性苦味酸产生Jaffe反应,生成橙红色的苦味酸肌酐复合物,在510nm处比色,在一定范围内吸光度与肌酐含量成正比。尿液样本可稀释后直接测定。
【器材与试剂】
1.器材 试管、试管架、离心机、离心管、刻度吸管、分光光度计。
2.试剂
(1)35mmol/L钨酸溶液:①将1g聚乙烯醇溶解于100ml去离子水中,加热助溶(不要煮沸),冷却。②将11.1g钨酸钠溶于300ml去离子水中,使其完全溶解。③在300ml去离子水中缓慢加入2.1ml浓硫酸,冷却,于1L容量瓶中,将①液加入②液中,再与③液混匀,加入去离子水至刻度,置室温保存,可稳定1年。
(2)40mmol/L苦味酸溶液:取9.3g苦味酸溶于500ml 80℃去离子水中,冷却至室温,加入去离子水至1L。用0.1mol/L NaOH滴定,以酚酞作指示剂。根据滴定结果,用去离子水稀释至40mmol/L。储存于棕色瓶中,室温可保存半年。
(3)0.75mol/L氢氧化钠溶液:取30g NaOH,加去离子水使其溶解,冷却后定容至1L。
(4)10mmol/L肌酐标准储存液:取113mg肌酐,用0.1mol/L盐酸溶解,并移入100ml容量瓶中,再用0.1mol/L盐酸定容至刻度。冰箱保存,可稳定1年。
(5)10μmol/L肌酐标准应用液:取1.0ml肌酐标准储存液于1L容量瓶中,用0.1mol/L盐酸稀释至刻度。冰箱保存可用2个月。
【操作】 准确吸取0.5ml血清(或血浆),加入35mmol/L钨酸溶液4.5ml,充分混匀, 3000r/min离心10min,取上清液即为无蛋白血滤液。按表10-3操作。
表10-3 碱性苦味酸比色法测定血清肌酐的操作步骤
【参考区间】 男性:44~133μmol/L;女性:70~106μmol/L。
【质量保证】
1.反应以15~25℃为宜。温度升高可使碱性苦味酸显色加深,测定管比标准管更明显。
2.显色后标准管色泽较稳定,测定管吸光度随时间延长而增加,可能与血清中非特异性物质(假性肌酐)与苦味酸发生反应有关,因此,加显色剂后应及时比色。
混匀,室温置15min,用分光光度计在510nm处比色,以空白管调零,读取各管吸光度。
【计算】
3.血清标本于冰箱保存3d,-20℃保存较长时间,轻微溶血对肌酐测定无影响。
4.尿肌酐测定,可用蒸馏水作1∶200稀释,按同样方法操作,结果乘以稀释倍数。
【应用评价】
1.特异性 特异性不高,易受蛋白质、葡萄糖、丙酮、丙酮酸、维生素C等影响。
2.回收率 受无蛋白血滤液p H的影响,滤液p H在3.0~4.5时,回收率为85%~ 90%;p H在2.0以下时,回收率为100%。
3.线性范围 上限可达1320μmol/L。
【临床意义】
1.血肌酐主要经肾小球滤过,几乎不被肾小管重吸收。肾小球滤过率下降至正常人的1/3时,血肌酐才明显上升,因此,肌酐测定是反映肾小球滤过率下降的后期指标,对肾病的早期诊断意义不大。
2.肾源性和非肾源性血肌酐增高程度不同,肾衰竭血清肌酐浓度常>200μmol/L,心力衰竭血肌酐浓度<200μmol/L。
(二)碱性苦味酸速率法
【原理】 在碱性环境中,肌酐与碱性苦味酸反应,生成橘红色的苦味酸肌酐复合物,样品中肌酐、干扰物与苦味酸的反应速度不同,选择合适的监测时间,可排除干扰物的影响,提高肌酐测定的特异性。
【器材与试剂】
1.器材 试管、加样器、恒温水浴箱、分光光度计或自动生化分析仪。
2.试剂
(1)40mmol/L苦味酸溶液:见碱性苦味酸比色法。
(2)0.32mol/L氢氧化钠溶液:取12.8g氢氧化钠,用蒸馏水溶解,冷却后定容至1L。
(3)碱性苦味酸溶液:将(1)液和(2)液等体积混合,放置20min后使用。
(4)100μmol/L肌酐标准应用液:参见碱性苦味酸比色法。
【操作】 按表10-4操作。
表10-4 碱性苦味酸速率法测定血清肌酐的操作步骤
分析仪波长510nm,比色杯光径1.0cm,反应温度37℃(或25℃),样品体积100μl,试剂体积1000μl。在试剂混合后,准确反应20s,读取吸光度A 20标和A 20测;待反应进行至60s时,读取吸光度A 60标和A60测。
【计算】
【参考区间】 男性:53~97μmol/L;女性:44~80μmol/L。
【应用评价】
1.特异性 特异性不高,易受蛋白质、葡萄糖、丙酮、丙酮酸、维生素C等的影响。
2.精密度 重复性较好,批内、批间CV<5%。
3.回收率 95.9%~101.2%。
4.线性范围 上限可达867μmol/L。
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