实验五裂解酶活性的测定

实验五　裂解酶活性的测定
——以醛缩酶为例

【实验目的】

掌握测定醛缩酶活性的一般方法。

【实验原理】

醛缩酶(aldolase，Ald)催化1，6-二磷酸果糖(fructose-1，6-disphosphate，FDP)裂解成一分子磷酸二羟丙酮和一分子3-磷酸甘油醛。

血清醛缩酶活性的连续监测有两条途径:一种是3-磷酸甘油脱氢酶耦联法，在NADH存在下磷酸二羟丙酮还原成3-磷酸甘油，于波长340 nm监测吸光度下降速率(NADH消耗速率);另一种是3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GLAPD)耦联法，在NAD存在下3-磷酸甘油醛氧化成3-磷酸甘油酸，于波长340nm处监测吸光度上升速率(NADH生成速率)。应用最多的是根据前一反应途径建立的测定方法。分析两法测定的主要干扰因素，前者受血液中丙酮酸的干扰;后者受血液中乳酸的干扰。一般情况下，以毫摩尔浓度相比，乳酸的含量要比丙酮酸的含量高十几倍。所以，后者所受干扰较大。

本方法在GALPD偶联反应前，加入乳酸脱氢酶以消除乳酸的干扰，然后加入底物，启动偶联反应，保证了测定结果的准确性。

【实验器材】

恒温水浴锅、可见/紫外分光光度计。

【药品试剂】

1．三乙醇胺(TEA)缓冲液:60 mmol/L TEA，12 mmol/L砷酸钠(Na₃AsO₄)，7．2 mmol/L NAD，pH 8．3。取TEA 1 ml，Na₃AsO₄ 508．8 mg，NAD477．6 mg，加入蒸馏水80 ml，用1 mol/L HCl调节pH值为8．3，再加蒸馏水至100 ml，置冰箱保存。

2．工具酶混合液:60 kU/L 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GLAPD)，12 kU/L磷酸丙糖异构酶(TPI)，36 kU/L乳酸脱氢酶(LD)。取1．6 mol/L(NH₄)₂SO₄1 ml，加入15μl GLAPD原液61 U(比活120 U/mg)，7μl LD原液37 U(比活1000 U/mg)、1μl TPI原液12．5 U(比活5600 U/mg)，混合备用。

3．54．5 mmol/L FDP溶液(酶底物):称取300 mg 1．6-二磷酸果糖(FDPNa₃·8H₂O)溶于10 ml TEA缓冲液(pH8．3)。临用前使温度平衡到37°C。

【实验方法】

1．取血清0．05 ml，加入1 ml TEA缓冲液和0．05 ml工具酶混合液，混匀后，置于37°C水浴中温育5分钟。

2．加入0．1 ml54．5 mmol/L FDP溶液，混匀，立即放入分光光度计中，在波长340 nm处，延迟时间30秒，监测时间180秒，每30秒读一次吸光度，计算平均每分钟吸光度上升速率(ΔA/min)。

一般以吸光度上升速率表示酶活性的高低。也可以根据下面的公式计算出Ald的活性单位。式中1/2为一分子1，6-二磷酸果糖分解成二分子磷酸丙糖的系数。

Ald U/L=ΔA/min×(10⁶/6220)×(1．20/0．05)×(1/2)

　　　=ΔA/min×1929

【注意事项】

各反应物的终浓度:三乙醇胺50 mmol/L，1，6-二磷酸果糖4．5 mmol/L，砷酸钠10 mmol/L，氧化型辅酶Ⅰ6 mmol/L，3-磷酸甘油醛脱氢酶2500 U/L，磷酸丙糖异构酶500 U/L，乳酸脱氢酶1500 U/L。

【思考题】

3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法和3-磷酸甘油脱氢酶偶联法在测定醛缩酶活性时各有哪些优缺点?应如何避免产生大的误差?