实验三转移酶活性的测定

实验三　转移酶活性的测定
——以谷丙转氨酶为例

【实验目的】

1．掌握测定谷丙转氨酶活性的原理。

2．掌握谷丙转氨酶活性测定的方法和注意事项。

【实验原理】

谷丙转氨酶(GPT)能催化丙氨酸和α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸在酸性条件下与2，4-二硝基苯肼可缩合生成丙酮酸二硝基苯腙，其在碱性条件下呈现棕红色，在一定的浓度下，颜色的深浅符合比尔定律，在520 nm处有最大吸收。根据颜色的深浅，通过比色法可计算出酶活性。

GPT在肝脏中含量最多，在某种药物对肝脏早期损害或病毒肝炎的急性阶段，由于肝细胞受损，GPT就释放到血液中，使血清中此酶水平明显升高。因此测定血清谷丙转氨酶的活性可作为诊断肝病的重要指标。

【实验材料】

鱼肌肉匀浆液或者血清。

【实验器材】

恒温水浴锅、分光光度计、试管等。

【药品试剂】

1．2 mmol/L丙酮酸标准溶液:称取22 mg丙酮酸钠，溶于pH7．4磷酸缓冲液中，定容到100 ml。

2．GPT底物溶液:称取α-酮戊二酸87．6 mg，丙氨酸5．34 g，用90 ml 0．1 mol/L pH7．4的磷酸缓冲液溶解，然后用20%NaOH调节pH值至7．4，加入磷酸缓冲液，定容到300 ml，4℃保存一周内使用。

3．0．1 mol/L pH7．4磷酸缓冲液。

4．2，4-二硝基苯肼溶液:称取19．8 mg 2，4-二硝基苯肼，置于100 ml容量瓶中，用8 ml浓盐酸溶解后，再加水稀释至刻度。

5．0．4 mol/L NaOH。

【实验方法】

1．标准曲线的制备:取干净试管6支，编号后按照下表添加试剂(表4-2)。将试管置于37℃水浴中保温10分钟，然后向每管中加入0．5 ml 2，4-二硝基苯肼，再继续保温20分钟。然后分别向各管中加入0．4 mol/L氢氧化钠溶液5 ml，室温下静止10分钟。用“0”号管作为空白对照，与520 nm下测定吸收值。以各管吸收值为纵坐标，丙酮酸的浓度为横坐标做标准曲线。

表4-2　　　　　　　丙酮酸标准浓度曲线的制备

2．GPT活性的测定:取干净试管4支，按照表4-3添加试剂。

表4-3　　　　　　　GTP活性的测定

3．由标准曲线查出1号和2号反应管中的丙酮酸的量，根据下面的公式计算GPT的活性。GPT活力(单位)=反应管中丙酮酸的量(mmol/L)/0．5小时×0．25 ml

GPT活力单位的定义:单位时间(每小时)内，单位体积(每ml)的酶反应生成的产物的量(mmol/L)。

【注意事项】

1．在呈色反应中，2，4-二硝基苯肼与带有酮基的化合物反应时形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸可以与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此在制备标准曲线的时候需要加入一定量的底物以抵消α-酮戊二酸的影响。

2．严格按照实验步骤进行，温度和时间均要严格控制。

【思考题】

1．简单描述谷丙转氨酶活性测定的原理和操作步骤以及注意事项。

2．测定血清中的谷丙转氨酶活性有什么生物学意义?