唾液溶菌酶活性测定

实验一　唾液溶菌酶活性测定

实验目的

（1）证实体液中溶菌酶的存在及其对革兰阳性菌的溶解作用。

（2）掌握用平板打孔测定法测定溶菌酶活性的方法。

实验原理

溶菌酶存在于机体的泪液、唾液、痰液、鼻涕及白细胞和血清中。溶菌酶是一种小分子蛋白，分子量约14kD，由129个氨基酸组成，是一种碱性蛋白质。溶菌酶能切断细菌胞壁多肽结构中的N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸之间的β－1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，破坏细胞壁。细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁的主要成分，革兰阳性菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。而革兰阴性菌胞壁肽聚糖层只有1～2层，肽聚糖外的脂多糖、外膜和脂蛋白结构是其细胞壁的主要成分，故在一般情况下溶菌酶不易直接溶解革兰阴性菌。

测定体液、分泌液中溶菌酶的含量及其变动情况，可以作为了解机体防御功能的一个侧面指标。该方法简便，不需特殊设备。正常人血清溶菌酶的含量不超过5～10mg/L，唾液溶菌酶含量在1．5～1．9mg/L之间，尿中通常查不出。各种类型的白血病，特别是单核细胞性白血病时，患者血清溶菌酶含量升高尤为明显。

体液或分泌物中溶菌酶活性，可通过检查其对指定敏感菌株的裂解作用来进行测定。测定方法有平板打孔测定法和光学测定法两种。光学测定法只适用于测定较窄范围浓度的溶菌酶，因此常需将待检品的浓度预先作适当的调整，使之在限定范围之内。平板打孔测定法可在一个较宽的浓度范围内获得满意的结果。本实验以平板打孔测定法为例。

实验材料

（1）溶壁微球菌　本菌是从空气中分离出的一种革兰阳性菌，对人不致病，对营养要求不高，在普通琼脂培养基上生长良好，菌落呈黄色，每月传代一次或冻干保存，用于制备溶壁微球菌琼脂平板。

（2）溶菌酶标准品　称取溶菌酶标准品，用1/15mol/L的PBS配制成5mg/L、25 mg/L、100mg/L的标准液，使用前保存在4℃冰箱中，用于阳性对照及制备标准曲线。

（3）唾液（或血清）　用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。

（4）其他　无菌打孔器（孔径3mm）、无菌毛细吸管、小米尺等。

实验方法

（1）溶壁微球菌琼脂平板的制备如下。

①溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面培养基上传代一次，然后再接种于琼脂平板37℃培养24h。用无菌蒸馏水洗下菌苔，2 000r/min离心30min，弃上清液。再加蒸馏水轻轻混匀，2 000r/min离心30min，弃上清液，称沉淀物的湿重，用无菌蒸馏水配成100g/L的浓菌液（菌液应在临用前配制，不宜存放过久），加热杀死，备用。

②称取琼脂粉1g，加入1/15mol/L pH值为6．4的PBS 100mL，即成1%琼脂。

③取已配制好的菌液1mL，加到50～60℃已熔化的1%琼脂中，摇匀，倾注平板（直径为7～9cm的平板，加1%琼脂15mL），冷凝后，置于4℃冰箱，保存备用。

（2）用无菌打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，孔间距5～20mm，用牙签挑去孔内琼脂。

（3）用毛细吸管吸取新鲜收集的唾液并加入琼脂孔内，每孔加一滴，每滴约为0．025 mL。

（4）置于25～30℃环境中18～24h，观察结果。

（5）在测定的同时，将各种浓度的溶菌酶标准液加于小孔中，同法测定溶菌环直径，用半对数纸，以溶菌酶浓度为纵坐标（对数坐标）、溶菌环直径为横坐标，绘制标准曲线。从标准曲线上查出每毫升待检品所含溶菌酶的质量（以微克计）。

实验结果

加唾液孔和标准溶菌酶孔周围的溶壁微球菌被溶解，可见圆形透亮区，即溶菌环。溶菌环的大小与溶菌酶的含量成正比。用小米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可从标准曲线上查出待检样品溶菌酶的含量。

注意事项

测量标准品与待检样品溶菌环大小的间隔时间应尽量缩短，最好能在同一块板上备有标准样品的对照，以便于比较。

思考题

当体液或分泌液中溶菌酶减少或缺乏时，临床上常易引起哪些部位感染和哪类病原菌感染？

（唐小云）