实验33 新鲜绿叶蔬菜中叶绿素a、b的含量测定
自然界中，植物的光合作用为人类利用能量提供了重要来源。植物体内的叶绿素和类胡萝卜素两类化合物，在光能作用下转化为化学能的光合作用过程中，起着重要的作用。主要包括叶绿素a、叶绿素b、β－胡萝卜素和叶黄素4种。它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量比例见表7－2。
表7-2 植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量
叶绿素（Chlorophylls，Chl）是叶绿酸的酯。主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。见图7－3。
在叶绿素分子结构中，4个吡咯环由4个甲烯基联结成卟啉环，中央的镁原子以共价键和配位键的方式与4个吡咯环的氮原子结合成内络盐，形成镁卟啉。分子中的两个羧基，一个与甲醇基化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。
类胡萝卜素（Carotenoids）是一类不饱和的四萜类碳氢化合物或它们的氧化衍生物，所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化，在弱光下可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。植物体内的类胡萝卜素以胡萝卜素和叶黄素为主体，它们是两种脂溶性化合物。胡萝卜素有3种异构体，即α－、β－和γ－胡萝卜素，其中β－胡萝卜素（β－Carotene）含量最多，也最为重要。在生物体内，β－胡萝卜素受酶催化氧化即形成维生素A。叶黄素（Lutein）是一种氧化型的类胡萝卜素。
图7-3 叶绿素和类胡萝卜素的基本结构
植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定在植物生理学和农业科学研究中具有重要意义。叶绿素等天然色素在食品工业和医药工业中也有广泛的用途。本实验测定新鲜绿叶蔬菜中叶绿素a、b的含量。
1.设计内容
用乙醇－石油醚从新鲜蔬菜叶片中提取叶绿体色素，用柱层析法将叶绿体色素分离，用原子吸收法测定叶绿素的含量，用分光光度法的多种方法、同步荧光光度法或高效液相色谱法同时测定叶绿体色素主要成分的含量。
2.提示
提取—纯化—分离—测定。
蔬菜的植物色素通常可用丙酮、乙醚、丙酮－乙醚、甲醇－石油醚及乙醇－石油醚等有机溶剂提取。叶绿素a和b都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，尽管它们分子中含有一些极性基团，但大的烷基结构使它易溶于醚、石油醚等非极性的溶剂。β－胡萝卜素和叶黄素是脂溶性的四萜化合物。与胡萝卜素相比，叶黄素易溶于醇而在石油醚中的溶解度较小。根据它们在有机溶剂中的溶解特性，可将它们从植物叶片中提取出来。由于粗提取液中还可能包括残余植物组织和其他可溶性杂质，实验中应对粗提取液进一步纯化。
色谱法（纸色谱、薄层色谱和柱色谱）是分离叶绿素等天然色素最有效的方法。可用中性氧化铝（250目）柱层析法将叶绿体色素分离。叶绿素a和b的分子结构相似，定量分离难度很大。
叶绿素a和b中均以卟啉环络合了一个镁原子，但在酸性条件下，极易被酸中的氢离子所取代。有反应方程式
因此，可将酸加入叶绿素的石油醚溶液，使镁原子变为镁离子，从而可以用水将镁离子从叶绿素的石油醚溶液中萃取出来。在定容后，就可以用原子吸收法来测定镁离子的量，然后推算出原叶绿素溶液中叶绿素a、b的总含量。
叶绿素a和b在可见光区均有吸收，它们的吸收光谱、荧光发射光谱重叠严重，用常规的吸光光度法、荧光光谱法难以实现测定。采用导数吸光光度或其他近代吸光光度技术，或同步荧光测定技术，可分别或同时测定叶绿素a、叶绿素b的含量。
高效液相色谱技术被认为是研究叶绿素和胡萝卜素的一种最有效手段。为改善分离和缩短分析时间，可对植物色素提取液用梯度洗脱反相高效液相色谱方式进行全分析。
注意：叶绿素受光会分解，在设计实验时应予以注意。
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