离子交换法纯化蔗糖酶

一、目的要求

1．学习离子交换层析的基本原理。

2．学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术。

3．学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。

二、实验原理

离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子交换剂为固定相、液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一p H值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的p H值改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。

三、仪器与试剂

1．实验材料

实验二所得蔗糖酶醇级分样品Ⅲ。

2．实验试剂

DEAE-Sepharose Fast Flow （弱碱性阴离子交换剂）；20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液（每组250 m L左右）；20 mmol/L Tris-HCl（1 mol/L Na Cl）（p H7.3）缓冲液（学生自配）；0.2 mol/L乙酸缓冲液，p H4.5；5%蔗糖溶液；3，5-二硝基水杨酸试剂。

3．实验设备

酸度计；高速冷冻离心机；层析柱（φ1.0×20 cm）（1支/组）；恒流泵（流速0.8～1 m L/min） （10 r/min）（1台/组）；梯度混合器（100 m L梯度杯）（1套/组）；核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组）；记录仪（纸速：0.5 mm/min；灵敏度：50 m V）（1台/组）；部分收集器及收集试管（4 m L/管）（1台/组）；铁架台、夹子 （固定层析柱用）（1套/组）；-20℃冰箱（保存样品用）；微量移液枪（200 μL、1 000 μL）；1.5 m L离心管；7 m L离心管；恒温水浴（100℃）；试管、移液管、试管架等。

四、实验操作与步骤

1．离子交换剂准备

取适量（1.5～2 g/每组）DEAE-Sephadex，加入0.5 mol/L Na OH溶液，轻轻搅拌，浸泡 0.5 h，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50 m L 0.5 mol/L HCl，搅匀，浸泡 0.5 h，同上，用去离子水洗至近中性，再用 0.5 mol/LNa OH 重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干后浸入 20 mmol/L Tris-HCl p H7.3 缓冲液中平衡备用（因 DEAE 纤维素昂贵，用后务必回收）。如果使用 DEAE-Sepharose Fast Flow，按说明书处理。

2．装柱与平衡

先将层析柱垂直装好，调好流速（0.8～1 m L/min），然后将柱下端的出水口关闭，加进5 m L 20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）的缓冲液，然后将处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态），沿玻璃棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。注意不能带进气泡，待凝胶自然沉积离柱管上端1～2 cm后松开层析柱出口，控制流速 0.8～1 m L/min；待柱内DEAE-Sepharose Fast Flow 凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端3 cm处为止（这时须保持DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。用20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的p H值一致。

3．样品的处理与上样

将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于15 m L 20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液；4℃ 15 000 r/min，离心10 min，收集样品上清液，测量总体积，留取1.5 m L样品用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定（可先取50 μL酶液立刻做酶活力检测，因为环境变化对酶活影响较大）；将其余样品待步骤2完成以后缓冲液液面与胶体表面相切时，用胶头滴管缓慢加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。

4．洗脱

洗脱方式有两种：梯度洗脱和等度洗脱，实验中选择其中一种。

梯度洗脱法步骤为：加样后，用20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8～1 m L/min，洗去未被DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液Na Cl梯度洗脱（浓度为0～1 mol/L Na Cl），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50 m L 0.05 mol/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液和50 m L含1 mol/L Na Cl的0.05 m L/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液。洗脱流速为0.8～1 m L/min，每4 m L接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积，并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定，样品低温-20℃保存。

等度洗脱法步骤为：加样后，用20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8～1 m L/min，洗去DEAE-Sepharose Fast Flow未吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。用浓度为0.15 mol/L Na Cl的20 mmol/L Tris-HCl（p H7.3）缓冲液继续洗脱被吸附的蔗糖酶蛋白，洗脱流速为0.8～1 m L/min，4 m L/管/5 min，直至待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定。测定各接收管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，量出总体积，并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定，样品低温-20℃保存。

5．蔗糖酶活力测定（参考实验二）

采用标准曲线法进行测定。首先制备标准曲线：以还原糖质量浓度（mg）为横坐标、A520 nm值为纵坐标，制作标准曲线。按照表 3-7-1 所列步骤操作，通过计算还原糖的量来计算酵母蔗糖酶酶活力。

表3-7-1 酶活测定结果

五、实验说明

从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。

六、思考题

1．什么是梯度洗脱？与等度洗脱比较，有哪些优势？

2．离子交换法纯化蛋白时，对所使用的离子交换剂有什么要求？