质粒（plasmid）是一种共价闭合环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，大小为1～200kb。它们独立于细菌的染色体，能够自主复制和转录，并且能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，表达所携带的遗传信息，所以常被用作基因工程的载体。
一、质粒提取原理
从细菌中分离质粒DNA时，首先采用溶菌酶破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用加热或强酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而质粒的两条闭合环状DNA链则不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起成为沉淀；而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒提取的主要步骤如下：
二、质粒DNA小量提取
（一）煮沸裂解法
【材料】
1．细菌 E. coli DH5α或JM系列菌株。
2．试剂
（1）LB液体培养基：称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压下蒸气灭菌20min。
（2）LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
（3）氨苄西林（Amp，氨苄青霉素）母液：配成 50mg/ml水溶液，－20℃保存备用。
（4）溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份保存于－20℃（每一小份使用即丢弃）。
（5）STET：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10mmol/L EDTA （pH 8.0）， 5% Triton X-100。
（6）3mol/L NaAc （pH 5.2）：50ml水中溶解40.81g NaAc•3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，4℃储存。
（7）异丙醇。
（8）70%乙醇。
（9）TE缓冲液：10mmo/L Tris-HCl（pH 8.0），1mmol/L EDTA（pH 8.0），高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
（10）胰RNA酶（10mg/ml）：将RNA酶A（RNase A）溶于10mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15min，使混有的DNA酶（DNase）失活，冷却后分装成小份，－20℃保存。
3．设备 微量移液器（20μl、100μl、1000μl）、台式高速离心机、恒温振荡摇床、高压蒸汽消毒器（灭菌锅）、恒温水浴箱、涡旋振荡器、1.5ml Eppendorf管（EP管）。
【操作步骤】
【注意事项】
（1）除去上清时，应尽可能去干净。
（2）当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101）中小量制备质粒DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg2+存在下温育时（如用限制性内切酶进行酶切反应），质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤（7）之前增加一步，即用酚∶氯仿进行抽提，可以避免这一问题。
（二）碱裂解法
【材料】
1．细菌 E. coli DH5α或JM系列菌株。
2．试剂
（1）LB液体培养基。
（2）LB固体培养基。
（3）氨苄青霉素（Amp）母液。
（4）溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10mmol/L EDTA （pH 8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15min，储存于4℃冰箱。
（5）溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L储存液现用现稀释），1% SDS。
（6）溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌，溶液终浓度为：[K+] 3mol/L，[Ac-] 5mol/L。
（7）Tris-饱和酚。
（8）氯仿：按氯仿∶异戊醇＝24∶1体积比加入异戊醇，等体积混合上述饱和酚与氯仿即得（25∶24∶1）。
（9）无水乙醇和70%乙醇（放置于4℃冰箱，用后立即放回）。
（10）TE缓冲液。
3．设备 微量移液器（20μl、100μl、1 000μl），高速冷冻离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，1.5ml EP管。
【操作步骤】
【注意事项】
（1）提取过程中应尽量保持低温。
（2）除去上清时，应尽可能去干净。
（3）溶液Ⅱ不可冷冻，现用现配。
（4）加入溶液Ⅱ注意不能过分用力振荡，是为了避免染色体DNA断裂成小片段，从而能与质粒DNA相分离，所以要温和混匀，冰上放置。加入溶液Ⅲ后应同样处理。
（5）加入溶液Ⅲ后复性时间不要太长，否则染色体DNA也会复性。
（6）提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净可多次抽提。
（7）加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒置摇动4～5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中，以获得更多的DNA沉淀。
（8）在用70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀时，应尽量将乙醇挥发干净，因为如残留较多乙醇，以后在做酶切鉴定时，乙醇会使限制性内切酶失活。
（9）酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套，注意不要溅到身上。
【结果与分析】
1．实验结果及分析 提取产物经琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到3个条带，自前往后分别为：超螺旋、线性和开环状质粒DNA（图6-1）。
图6-1 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳图
M：DNA分子量标准（DL15 000）；1和2：提取的质粒DNA
超螺旋质粒DNA、线性质粒DNA和开环状质粒DNA这3种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线性分子，最慢的为开环状分子。
2．常见问题及解析 见表6-1。
表6-1 碱裂解法常见问题及解析
（续表）
（三）试剂盒法（以Qiagan质粒DNA小量制备试剂盒P1asmid Mini Kit为例）
【试剂】
（1）纯化柱（QIAGEN-tip 20）。
（2）Pl缓冲液（Buffer P1）：50mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10mmol/L EDTA，100μg/ml RNase A，4℃保存。
（3）P2缓冲液（Buffer P2）：200mmol/L NaOH，1%SDS，室温保存。
（4）P3缓冲液（Buffer P3）：3.0mmol/L乙酸钾（pH 5.5），室温或4℃保存。
（5）QBT缓冲液（平衡缓冲液）：750mmol/L NaCl，50mmol/L MOPS（pH 7.0），15%异丙醇，0.15%Triton X-100，室温保存。
（6）QC缓冲液（冲洗缓冲液）：1.0mmol/L NaCl，50mmol/L MOPS（pH 7.0），15%异丙醇，室温保存。
（7）QF缓冲液（洗脱缓冲液）：1.25mol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl（pH 8.5），15%异丙醇，室温保存。
（8）RNase A（100mg/ml）。
（9）异丙醇。
（10）70%乙醇。
（11）TE缓冲液。
【操作步骤】
三、质粒DNA大量提取
这里主要介绍用碱裂解法大量提取质粒DNA。
【材料】
1．细菌 E. coli DH5α或JM系列菌株。
2．试剂
（1）LB液体培养基。
（2）LB固体培养基。
（3）氨苄青霉素（Amp）母液。
（4）STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1mmol/L EDTA（pH 8.0）。
（5）溶菌酶溶液（10mg/ml）。
（6）胰RNA酶（10mg/ml）。
（7）溶液Ⅰ。
（8）溶液Ⅱ。
（9）溶液Ⅲ。
（10）20% 聚乙二醇（PEG，分子量6 000D）/2.5mol/L NaCl。
（11）Tris-饱和酚。
（12）氯仿/异戊醇＝24∶1（体积比）。
（13）预冷无水乙醇和70%乙醇。
（14）TE缓冲液。
3．设备 微量移液器（100μl、1 000μl），高速冷冻离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），恒温水浴箱，涡旋振荡器，真空离心干燥机，500ml离心管，250ml离心管，50ml离心管。
【操作步骤】
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