纯化方法的选择

纯化方法的选择_超氧化物歧化酶

15．1．4　SOD纯化方法的选择

酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用。表15－3列出了最常用的纯化方法。

表15－3　常用的提纯方法

15．1．4．1　调节酶溶解度的方法

（1）改变离子强度。蛋白质在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子相互作用，所以能保持溶解状态。当加入盐离子时，蛋白质分子周围所带电荷增加，促进了与溶剂分子的相互作用，溶解度增加，这种现象称为盐溶。但当盐浓度继续加大时，大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质的水化作用减弱，相互凝聚而沉淀出来，这就是盐析。大部分酶在细胞中呈溶解状态（达细胞总量的40%），在中性pH和离子强度为0．5～0．2mol/L的生理条件下极易溶解，因此得到粗酶抽提液后，改变这些条件就可使酶沉淀析出。

盐析时常用的盐有钠、钾、铵的硫酸、磷酸及柠檬酸盐。硫酸铵因具有高溶解度，对酶作用温和且价廉等特点而最为常用。由于各种酶在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度不同，故可采用分级沉淀法分离酶。如兔肝SOD分离时，在粗抽提液中加入固体硫酸铵至40%饱和度，将部分杂蛋白沉淀，离心去除。在上清液中继续加固体硫酸铵至75%饱和度，将SOD沉淀下来，离心得到沉淀，即为第一步纯化的兔肝SOD。

一种最有用的硫酸铵分级改进法即所谓反抽提法（back extraction）。以E．coli RNA聚合酶的硫酸铵分级沉淀为例：此酶通常在42%～50%硫酸铵饱和度时沉淀。用通常的分级沉淀方法是加硫酸铵至33%饱和度，弃去沉淀。在上清液中再加入硫酸铵至50%饱和度，析出RNA聚合酶。分离出沉淀，溶解于含有适当离子强度的缓冲液中。而反抽提法则是将该沉淀再悬浮于42%饱和度的硫酸铵溶液，这时沉淀中原来带有的某些杂蛋白又溶解了，而RNA聚合酶仍留在沉淀中，因而得到分离。换言之，反抽提法的原理就是将包括要分离的酶在内的多种蛋白质一起先沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。这种方法的优点在于许多蛋白质从溶液中沉淀析出十分容易，是非特异性的，但反过来，沉淀在溶液中溶解却有相当高的特异性。

硫酸铵反抽提法在提取易失活的酶时更有其优越性。例如，与Cu，Zn－SOD相比，肝脏Mn－SOD很不稳定，容易失活。采用一般硫酸铵分级沉淀法纯化时，得率较低。若用反抽提法，将肝脏组织在85%饱和度的硫酸铵溶液中匀浆破碎，离心得到沉淀，再用65%饱和度硫酸铵溶液洗涤，弃去上清液，再以35%饱和度的硫酸铵溶液抽提，Mn－SOD得率较高。此外，反抽提法还用于多酶体系的纯化过程。使用这一方法通常酶活性回收较高，这可能是由于酶蛋白在非溶解状态较能抵御蛋白酶攻击的缘故。

具体进行硫酸铵盐析操作时还应注意两点。一是溶液的pH值。硫酸铵略呈酸性，大量加入会改变溶液pH值，一般可用稀浓度氨水来校正；二是硫酸铵应在搅拌中缓慢加入，避免溶液中硫酸铵局部浓度过高，当然搅拌需温和，避免产生大量气泡。

硫酸铵分级沉淀法通常可去除抽提液中75%的杂蛋白，并可大大浓缩酶液，浓缩程度取决于用多少溶液溶解沉淀的酶蛋白，酶液体积越小，后续上柱分离就越容易。

（2）改变pH值或温度。酶在等电点时，溶解度最小。将溶液pH值调到酶的等电点，可使酶沉淀析出。但在未纯化前酶的等电点一般是未知的，需慢慢摸索，对某一特定的酶而言，pH值变化范围不宜过大，以免酶失活。

利用温度的变化来改变酶的溶解度比较难控制。但如果纯化一些对热不敏感的酶，这一方法有着不可比拟的优点。如在纯化Cu，Zn－SOD时，将溶血液在70℃加热10min，很多杂蛋白变性被除去，而Cu，Zn－SOD仍稳定地存在于溶液中。使用这一方法应注意酶溶液从一个温度加热到另一温度时时间要短，并在加热完毕后尽快回复原温度。

（3）改变介电常数。在溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可显著降低溶液的介电常数，从而使酶分子相互之间的静电作用加强而发生沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。当溶液中存在有机溶剂时，酶蛋白的溶解度随温度的下降而显著降低，因此尽可能在低温下进行操作。这样不但可以减少加入的有机溶剂量，更重要的是减少了有机溶剂对酶的失活作用。有机溶剂沉淀法较一般盐析法（如硫酸铵沉淀法）分辨率高。有时仅用这一方法就可将某些酶纯化，如乙醇沉淀法可纯化蓖麻过氧化氢酶。

但是，有些酶即使操作温度再低，一遇到有机溶剂即大量失活。如Mn－SOD在低温下用丙酮氯仿处理会完全失活。这类酶的纯化就应严格避免接触有机溶剂。

（4）萃取分离。萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互补相溶的两个液相。有时也采用其他流体。

按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、液膜萃取、双水相萃取和超临界萃取等。

A）有机溶剂萃取。有机溶剂萃取的两相分别为水相和有机溶剂相，利用溶质在水和有机溶剂中的溶解度不同而达到分离。

用于萃取的有机溶剂主要有乙醇、丙酮、正丁醇、苯酚等。例如，用正丁醇萃取线粒体或线粒体中的酶。由于有机溶剂容易引起酶蛋白的变性失活，所以在酶的萃取过程中，应在0℃～10℃的低温条件下进行，并要尽量缩短酶与有机溶剂接触的时间。

B）双水相萃取。双水相萃取中使用的双水相一般由按一定百分比组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或者两种互不相溶的高分子溶液组成。例如，硫酸铵溶液和聚乙二醇（PEG）溶液；聚乙二醇溶液和葡萄糖溶液等。

在双水相系统中，酶在两相中的溶解度不一样，分配系数不同，从而达到分离。

a）双水相的形成。双水相系统，一般是指将两种亲水性的聚合物都加在水溶液中，当超过某一浓度时，就会产生两相，两种聚合物分别溶于互不相溶的两相中，如用等量的1．1%的右旋糖酐溶液和0．36%甲基纤维素溶液混合，静置后产生两相，上相中含右旋糖酐0．39%，含甲基纤维素0．65%，而下相中含右旋糖酐1．58%，含甲基纤维素0．15%。一般认为，成相是由于聚合物之间的不溶性，即聚合物分子的空间阻碍作用，无法相互渗透，不能形成均一相，从而具有相分离的倾向；在一定条件下，即可分为两相。聚合物和盐类溶液也能形成两相，这是由于盐析作用。利用生物物质在两相中不同的分配，可以实现它们的分离。典型的两相系统列于表15－4。

表15－4　各种双水相系统

在双水相萃取过程中，关键是制备好双水相系统（aqueous two－phase system）。制备双水相系统，首先要选择好适宜的溶质，常用的有聚乙二醇、葡聚糖、聚蔗糖等水溶性高分子化合物以及硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠、甲酸钠、酒石酸钾钠等。其次是配制好溶液的浓度和两种溶液的比例，在双水相系统中，水的含量一般很高，达85%以上。将一定浓度和比例的两种互不相溶的水溶液充分混合，静置一段时间，即可形成两相。

图15－1　双水相系统相图

双水相形成的条件和定量关系可用相图表示，对于两种聚合物和水相组成的系统，其相图如图15－1所示。

从图15－1中可以看到，只有当P和Q的浓度达到一定时才能形成两相，图中曲线TCB称为双节线，直线TMB称为系线，在双节线下方的区域是均匀的单相区，在双节线上方的则是双相区。在T点和B点，分别表示到达平衡时的上相组成和下相组成，但体积比不同。

以V_t和V_b分别代表上相和下相的体积，BM表示点B与点M之间的距离，BT表示点B与点T之间的距离，则它们之间的关系为V_t/V_b＝BM/BT。

当系线下移，系数与双节线的交点分别为T′和B′点，系线长度逐渐减小，这说明两相之间的差别逐渐减少，当达到C点时，系线的长度为零，说明达到了均相，点C称为临界点。双节线的位置形状与聚合物的相对分子质量有关，聚合物的相对分子质量越高，相分离所需要的浓度越低；两种聚合物的相对分子质量相差越大，双节线的形状越不规则。

b）影响物质分配平衡的因素。影响酶在两相中分配系数的主要因素有：①两相的组成；②高分子聚合物的质量浓度、极性等；③酶的相对分子质量、电荷、极性等；④两相溶液的比例；⑤温度、pH值等。对于酶在两相中的分配系数，目前尚无成熟的理论可作为依据，需通过试验来确定。

亲和分配双水相萃取技术可用于酶及蛋白质的分离纯化。

C）超临界萃取

超临界萃取又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离目的的一种萃取技术。

物质在不同的温度（T）和压力（p）条件下，可以以不同的形态存在，如固体（S）、液体（L）、气体（G）、超临界流体（SCF）等，如图15－2所示。在温度和压力超过某物质的临界点时，该物质成为超临界流体。

图15－2　超临界系统相

超临界流体的物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间，适于作为萃取溶剂。超临界流体具有和液体同样的溶解能力。超临界流体的溶解能力与其相对密度有很大的关系。超临界流体的相对密度比气体大得多，与液体较为接近，因此超临界流体萃取具有很高的萃取速度。随着温度和压力的变化，超临界流体对物质的萃取有选择性，萃取后易分离，其扩散系数接近于气体，通常是液体的近百倍。超临界流体的黏度大大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质的扩散。在超临界流体中，不同的物质有不同的溶解度，溶解度大的物质溶解在超临界流体中，与不溶解或溶解度小的物质分开。然后，通过升高温度或降低压力，使超临界流体变为气态，而得到所需的物质。

作为萃取剂的超临界流体必须具有以下条件：具有良好的化学稳定性，对设备没有腐蚀性；临界温度不能太高或太低，最好在室温附近或操作温度附近；操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度；临界压力不能太高，可节约压缩动力费；选择性要好，容易制得高纯度的制品，溶解度要求高，可减少溶剂的循环量；萃取剂要容易获得，价格要便宜。

在相同的压力和温度条件下，同一物质的液相和气相的物理特性是截然不同的，如在101．325kPa下，10℃，液体和气体CO₂的相对密度分别是0．86和0．14；在20℃时，密度分别为0．77g/mL和0．19g/mL；30℃时，分别变成0．59g/mL和0．35g/mL。当温度和压力达到某一特定的数值时，气体和液体的物理特性就会趋于相同。这个数值称为超临界点。当温度和压力超过其临界点时，两相变为一相，这种状态下的流体称为超临界流体。不同的物质有不同的超临界点和超临界密度，见表15－5所列。

表15－5　某些超临界流体的超临界点和超临界密度

目前在超临界萃取中最常用的超临界流体是CO₂，二氧化碳超临界点的温度为31．1℃，超临界压力为7．38MPa，超临界密度为0．46g/mL。特别适用于生物活性物质的提取分离。

反胶束系统作为液－液萃取方法，更具有选择性。其基本过程是：首先在酶蛋白相转移最佳的条件下，将酶从水相中萃取到反胶束相中；第二步，在最佳条件下，将酶蛋白从反胶束转移到第二种水相中，即将酶从有机相中提取出来。

在反胶束萃取中，首先要根据欲分离组分的特性，选择适宜的表面活性剂及有机溶剂。

表面活性剂是由极性基团和非极性基团组成的两性分子，有阳离子、阴离子和非离子型表面活性剂。在反胶束萃取中，表面活性剂通常与某些有机溶剂一起使用，见表15－6。

表15－6　反胶束萃取中常用的表面活性剂及其相应的有机溶剂

最常用的是阴离子表面活性剂，如AOT（Aerosol OT），其化学名为丁二酸乙基己基酯磺酸钠。这种表面活性剂的特点是具有双链，极性基团小，形成反胶束时不需借助表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，有利于大分子蛋白质进入。

15．1．4．2　根据酶分子大小、形状不同的分离方法

（1）离心分离。离心方法在酶分离纯化中最为常用。使用时首先应该考虑如何确定离心转速和离心时间。许多酶往往富集于细胞中某一特定的细胞器内，因此匀浆处理后应先通过离心得到某一特定的亚细胞器组分，如细胞核、线粒体、溶酶体等使酶先富集10～20倍，然后再对某一特定的酶进行纯化。

在酶的分离纯化过程中，离心分离的一般目的是为了压实沉淀，澄清上清液，因此对于一般的沉淀分离，如硫酸铵分级沉淀、有机溶剂沉淀，选用4　000～6　000r/min足以够用，对于线粒体之类的细胞器，则需176．4N（18　000r/min）以上的离心力才能进行较好的分离。离心力较大，达到分离所需的离心时间越短，反之亦然。在条件许可和不影响分辨率的情况下，可选用稍大一些的离心力，以节省离心时间。

（2）凝胶过滤。凝胶过滤法分离酶蛋白质时，由于大的蛋白质分子被凝胶颗粒排斥，因而在颗粒外移动，速度较快；小分子蛋白质则进入凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢，从而根据分子大小将各种组分拉开（见图15－3）。常用于凝胶过滤的介质有Sephadex G系列、Bio－GelAP系列、Sepharose等。

图15－3　凝胶过滤分离示意图

凝胶过滤法在实际操作时，首先应选择具有合适孔径的分离介质，使待分离的酶蛋白的相对分子质量落在可分离的有效范围内。颗粒干粉经充分溶胀、脱气后，即可装柱平衡。溶胀时通常可将干粉放在水中过夜，或在沸水浴中加热2h。柱子要垂直放置，装柱完毕后，通常还需用0．2%蓝色葡聚糖（M_r＝2　000　000，1/50～1/100床体积）来检查装柱的均匀性和空柱体积V₀（即柱中颗粒外的溶剂体积）。上样体积不宜超过凝胶的体积V_t的3%，一般以V_t的1%为宜。洗脱液的体积以（V_t－V₀）的80%左右。凝胶过滤用的缓冲液要具备一定的离子强度，以减少蛋白质分子间非专一性的静电相互作用的影响。在使用Sephadex G系列凝胶柱时，还需特别注意操作压，以免压力过高，压实凝胶，影响流速。凝胶柱不用时，加入0．02%叠氮钠溶液或0．02%柳硫汞溶液加以保存，以防微生物污染。

（3）透析。通常不作为纯化酶的一种单元操作，但它在纯化过程中极为常用，通过透析可除去酶液中的盐类、有机溶剂、小分子抑制剂等。此外，采用聚乙二醇、蔗糖反透析还可对少量酶进行浓缩。

透析膜（袋）其截留极限一般在M_r为5　000左右。因此，如果将相对分子质量在1万以下的酶液进行透析时，就有泄漏的危险。透析袋在使用前最好在EDTA－NaHCO₃溶液中煮过，以除去生产过程中混入的有害物质，特别是还应检查一下有无破损、泄漏处，这样才能装入待透析液，两头扎紧，进行透析。一般透析液需更换3～5次。透析袋使用完后，一般可用清水冲洗干净，再次检查是否完好，然后浸入75%乙醇溶液中保存备用。

超滤（或超过滤）是在一定压力（正压或负压下）下将料液强制通过一固定孔径的膜，以达到分离纯化的目的，这一方法在提纯酶时，既可直接用于纯化过程，又可用于纯化过程之间（如酶液的浓缩等）。在纯化枯草杆菌SOD时，菌体经裂解后用孔径为0．8μm和0．22μm的微滤膜进行微滤，最后分别用截留为1万和10万的超滤膜进行截留，就可以得到SOD的粗抽提液。

超滤膜通常用纤维素、聚砜等材料制成，具各向异性，因此使用时要注意膜的正反面，不要搞错。超滤膜在使用后要及时清洗，一般可用超声波、中性洗涤剂、蛋白酶液、次氯酸盐及磷酸盐等处理，使膜基本恢复原有通水量。如果超滤膜暂时不再使用，可浸泡在加有少量甲醛的清水中保存。常用的超滤器种类和性能见表15－7。

表15－7　超滤器的种类和性能

15．1．4．3　根据酶分子电荷性质的分离方法

离子交换柱层析。离子交换柱层析是依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。各种蛋白质分子由于暴露在分子外表面的侧链基团的种类和数量不同，在一定的离子强度和pH值的缓冲液中，所带电荷的情况也是不相同的。如果在某一pH值时，蛋白质分子所带正负电荷量相等，整个分子呈电中性。这时pH值即为该蛋白质的等电点。参与蛋白质电荷特性形成的氨基酸主要有组氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸，以及肽链末端氨基酸等。如当pH＜6．0时，天冬氨酸和谷氨酸的侧链带有负电性，当pH＞8．0时，半胱氨酸的侧链由于巯基的解离，也带负电荷，如果pH＜7，组氨酸残基带正电荷，大多数蛋白质等电点多在中性附近，因而层析过程可以在弱酸或弱碱条件下进行，避免了交换时pH急剧变化而导致蛋白质变性。

用于酶蛋白离子交换分离的载体，往往是高亲水性的、不会引起生物分子的变性失活。常用的离子交换介质见表15－8。

表15－8　酶纯化过程中常用的离子交换介质

离子交换柱的柱长通常为柱径的4～5倍。离子交换剂如CM－纤维素或DEAE－纤维素，在装柱前应充分溶胀（在10倍量的蒸馏水中溶胀一夜或在100℃的沸水浴中溶胀1h以上），倾析除去过细粒子，然后用2～3倍量的0．5mol/L HCl和0．5mol/L NaOH溶液进行循环转型，每次转型至少维持10～15min。对于阳离子交换剂，转型次序为酸—碱—酸，而阴离子交换剂则为碱—酸—碱，经平衡缓冲液平衡，即可进行层析操作。加入柱中的蛋白量一般约为柱中交换剂干重的1/10到1/2之间，样品体积也尽可能小，以得到理想的分辨率。洗脱时，可以通过提高洗脱液的离子强度、减弱蛋白质分子与载体亲和力的方法，逐一洗脱各蛋白质组分，也可改变洗脱液的pH值，使蛋白质分子的有效电荷减少而被解吸洗脱。

使用过的离子交换剂可用2mol/L NaCl彻底洗涤，阳离子交换剂转成H^＋型或盐型储存，弱碱性阴离子交换剂以OH^－型储存，中等和强碱性阴离子交换剂以盐型储存，并且加入适当的保存剂。

15．1．4．4　根据酶分子的专一性结合的方法

（1）一般亲和层析技术。酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行分离纯化的技术称为亲和纯化技术（affinity purification），简称亲和层析（affinity chromatography）。该技术的要点为：①寻找可与底物（S）专一可逆结合的配基；②将配基（L）通过共价键偶联到基质，并要求偶联后L与S的亲和力不变；③S与L吸附并与杂质分离，将杂质洗出；④洗脱目标物，即被分离纯化。其过程大致分为三步（见图15－4）。

图15－4　亲和层析的原理

a）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质。

b）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。

c）样品解析：选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其他生物活性物质解析下柱。

亲和层析的介质，一般要具备以下特点。

①非特异性吸附要尽可能小。

②高度亲水性，不引起酶蛋白的变性失活。

③化学和机械性能稳定。

④具有高效的多孔结构，比表面积大。

⑤具备大量可被活化偶联的基团。

⑥配接的“手臂”（spacer）长度要合适，“手臂”和酶蛋白分子应尽可能避免非特异性相互作用。

常用的载体有琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠，其中以4%的交联琼脂糖（Sepharose 4B）最为常见。

琼脂糖的活化常采用溴化氰法。能使脂肪族伯胺或芳香胺类与活化的载体共价结合。此外，还可采用三嗪法（图15－5（a））、高碘酸盐氧化法（图15－5（b））、苯醌法（图15－5（c））、环氧化物法（图15－5（d））等进行活化。

对于聚丙烯酰胺，可以用制备酰胺衍生物的方法来活化。而多孔玻璃的活化，常用硅化法来进行。有时配基与载体偶联后，由于载体的空间位阻影响，配基与酶蛋白不能很好结合，需另加一手臂。一些双胺类化合物，如己二胺、3，3′－二氨基二丙胺等，常被用作“手臂”，这些双胺的烃链H₂N（CH₂）_nNH₂可长可短，视需要而定。

图15－5　其他活化载体的方法

不过，手臂过长，虽回旋角度大，接触空间广，但载体与手臂、各手臂与各配体间不免会有相互作用，反而不利于与酶分子结合。另外，长脂肪链本身也会与蛋白质发生非专一性的疏水相互作用，影响分离效果，已有人建议选用亲水性的手臂，以降低这种非专一性的吸附效应。

酶蛋白经亲和吸附后，可以通过改变缓冲液离子强度和pH值的方法，将酶洗脱下来。也可以使用浓度更高的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱，这就是亲和洗脱。还有一种亲和洗脱概念，就是先用离子交换层析柱将所要分离的酶吸附到载体上，再用适量的酶的底物将酶洗脱下来。这种方法一方面无需费力准备亲和层析柱，另一方面通常用调整缓冲液的浓度或pH值的方法来洗脱，分辨力不高，其他电荷性质相近的蛋白也会随所要的酶一起流出，改用亲和洗脱，就能大大改善洗脱效果。

（2）免疫亲和层析。抗原－抗体反应的高专一性经常被用于分离纯化过程。如果用传统方法从一个生物种属中得到少量的纯酶（如0．1mg），利用它在另一种属（通常为兔、羊或鼠）中产生多克隆抗体，这些抗体由于各自识别酶的不同抗原决定簇，因此与酶的亲和力也大小不一。抗体经纯化后，偶联到溴化氰活化的Sepharose上，即可用于从混合物中分离出酶抗原。利用改变洗脱液的pH值，增加离子强度或其他降低抗原抗体结合力的方法将吸附的酶解吸洗脱。解吸过程可能是整个纯化过程中最为困难的一步。因为酶在剧烈的解吸过程中，可能会大量失活，回收率大大降低。

单克隆抗体（McAb）制备技术的应用解决了许多在多克隆抗体使用中遇到的问题。首先，作为抗原的酶不用很纯，在筛选分泌特异抗体的细胞株时，可以筛去也分泌无关抗体的细胞株；其次，由于通常用小鼠免疫制备McAb，抗原酶的用量很小，有时50μg足以够用。而且，作为抗原的酶可含有不同的抗原决定簇，因而，同一抗原可产生许多不同的McAb，从中挑选出亲和力适中的McAb来制备亲和介质。这样，既能高效吸附目的酶，又可避免后面洗脱困难的缺陷。所以，用McAb制得的亲和柱，其柱效往往很高，而且McAb还可通过体外大规模培养大量制备。

图15－6　产生及克隆分泌抗体杂交瘤的常规步骤

众所周知，所有动物产生抗体的淋巴细胞在体外培养条件下，其生存时间极短。而骨髓瘤细胞能在体外长期培养生长，但不能产生专一性的抗体。将这两类细胞融合得到的杂交细胞就兼有两者的长处：既能长期培养生长，又能分泌所需要的特异抗体。因此，我们可以将需要纯化的某一酶的酶液（不需要很纯）作为抗原去免疫动物，然后分离出这一动物的脾细胞，与遗传缺陷型骨髓瘤细胞相融合。经多次克隆后，挑选出能单一分泌这种酶抗体的杂交瘤细胞，再经扩大培养，即可大量得到这种酶的McAb（见图15－6）。

最常用的骨髓瘤的细胞突变系，其缺乏次黄嘌呤、鸟嘌呤、核糖基转移酶或缺乏胸腺嘧啶核苷激酶，这些突变系由于缺乏DNA补救旁路的酶，在含偶氮鸟嘌呤或溴脱氧尿苷的培养液中均可生长。同理，它们也不能利用外源性次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷。若用氨基喋呤阻断DNA前体内源性合成，即使在培养液中含有次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，细胞仍将死亡。这种含氨甲喋呤、次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷的培养液简称HAT培养液。骨髓瘤突变系细胞，如果同野生型含补救旁路酶的脾细胞形成杂交细胞，便能在HAT培养液中生长，因而就可挑选出不同于两种母本细胞、可大量繁殖且能分泌特异抗体的杂交细胞。

骨髓瘤细胞突变系的应用，简化了挑选过程，大大节约了时间，促进了McAb技术的发展。McAb技术已被用于从牛脑中提取芳香族L－氨基酸脱羧酶，以及从基因工程菌发酵液中提取重组人α干扰素等。

（3）金属亲和层析（IMAC）。金属离子亲和层析（见图15－7）是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。目前蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合，这也是IMAC用于蛋白质分离纯化的理论依据。金属离子如锌和铜，已发现能很好地与组氨酸的咪唑基及半胱氨酸的巯基结合。含有不同数量这些基团的蛋白质可以通过金属离子亲和层析得到分离。它们具有以下优点：①蛋白质吸附容量大，是天然配基结合量的10～100倍；②价格便宜；③具有普遍适用性。金属离子配基具有很好的稳定性，吸附容量大，成本很低，且层析柱可长期连续使用，易于再生。有人以壳聚糖涂层固定化Cu^2＋亲和层析分离超氧化物歧化酶（SOD），纯化倍数达20倍，活性回收率为90%。Anshuman等利用固定化Cu^2＋亲和层析分离大肠杆菌细胞抽提物，通过不同的洗脱条件分别得到细胞色素c和溶菌酶（lysozyme）。金属离子亲和层析与免疫亲和层析比较起来，对蛋白质的特异性差，会发生非特异性吸附，结合常数K在104～105。为了增加结合的特异性，可以通过基因工程人工合成多组氨酸残基尾巴（polyH尾巴），添加到蛋白质的C端。这种基因工程蛋白与料液中的其他蛋白质相比，将会对金属离子具有更高的特异性。在分离纯化后，可再将尾巴剪切掉。但是，运用基因工程的手段，便会产生与抗体配基同样的问题。另外，螯合在亲和载体上的金属离子在操作过程中有可能脱落而混入产品中，严重影响产品质量。

图15－7　两种分子三维结构的比较

（4）亲和超滤。亲和超滤（见图15－8）是把亲和层析的高度专一性与超滤技术的高处理能力相结合的一种新颖分离方法。需要提纯的粗酶自由存在于抽提液时，可以顺利通过截留相对分子质量较大的超滤膜。但当酶与大分子亲和配体混和，形成酶配体复合物后，由于其相对分子质量远大于超滤膜的截留相对分子质量，因而被截留。提取液中其他未被结合的组分仍可顺利通过超滤膜，分离出上述复合物后洗去杂质，再用合适的洗脱液洗脱，使酶解吸下来；再通过一次超滤膜，把大分子配体分离出来，供再生使用。透过的酶液再经截留相对分子质量小的超滤膜进行浓缩。

图15－8　亲和超滤的原理

亲和超滤技术的关键在于选择合适的配体、载体及合适截留相对分子质量的超滤膜。配体对所分离对象的亲和力要好，专一性要高，在亲和、洗脱条件下很稳定，抗剪切力，易回收等。常用的载体一般有聚丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、淀粉等。一个好的载体应该具有高度亲和性，不引起酶的失活，能自由悬浮于提取液中，不易产生膜的浓差极化和堵塞现象。超滤膜的截留相对分子质量决定了超滤的透过速率。截留相对分子质量越大，水通量也越大，超滤越容易进行。

亲和超滤技术既克服了超滤技术选择性不高的缺点，又解决了亲和层析技术只能间隙操作，单批处理量小的不足，具有广阔的应用前景。

（5）亲和膜。亲和膜（Affinity membrane）（见图15－9）利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变型。所以，利用亲和膜的纯化方法又称膜亲和层析（membranbased affinity chromatography）。

图15－9　亲和膜概念的提出

传统的固定床型亲和层析利用多糖凝胶或硅胶等多孔粒子为固定相，床层压降随流速线性增大；由于软凝胶类固定相离子的机械强度较低，容易发生受压变形，在较高压力下，流速随压力提高而下降。因此，利用软凝胶为固定相的层析操作速度有限。利用刚性粒子（如硅胶）为固定相虽然可通过增大压力提高流速，但高压操作势必增大设备投资。因此，层析柱一般采用径向放大的方式，以保证不增大压力的前提下提高层析柱的处理量。如果层析柱的体积一定（即料液处理能力一定），降低柱高而增大柱径可在相同压降下提高流速，即提高层析分离速度，因此“短粗”性亲和层析柱有利于提高分离操作速度。为使层析柱的分离速度达到可能的极限值，“理想”的层析柱几何形状应该是柱高无限小（实际的极限情况下等于介质直径），柱径无限大。

但是，实际的固定床不可能实现这一“理想”，而微滤膜可接近这一“理想”状态，如图15－9所示。这就是利用微孔膜为亲和配基载体的原理。将一张微滤膜比喻为一个固定床，则膜厚即为床层高度。图15－10所示为亲和膜吸附原理，亲和配基固定在膜孔表面，流体在对流透过膜的过程中目标蛋白质与配基接触而被吸附。

图15－10　亲和膜吸附原理

亲和膜的纯化过程明显有两个特点：

①传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高；

②压降小，流速快，设备体积小，配基用量低。

但是亲和吸附也存在一些缺点。从分离效果的角度，因膜的厚度（柱高）很小（一般为10～100μm），理论板数很少，吸附和清洗效率低。另一方面，膜的污染和膜孔的堵塞使操作速度、吸附效率和亲和膜的寿命下降，也是必须解决的问题。除亲和膜外，用离子交换基团修饰微滤膜可制备离子交换膜（ion－exchange membrane），用于生物产物的离子交换分离。离子交换膜的原理和特点与亲和膜相同，但分离的选择性不如亲和膜。