产物的柱纯化

实验三　PCR产物的柱纯化

一、实验目的

学习使用DNA片段纯化回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收、纯化目的DNA。

二、实验原理

胶回收试剂盒的核心是含离子交换树脂（Resin）的离心柱，DNA首先被溶解于高盐、低pH的缓冲液中，并被加入离心柱中。此时，DNA会与离心柱中的离子交换树脂结合，而其他杂质（如蛋白质等）则不会结合。洗去杂质后，再加入低盐、高pH的缓冲液，离子交换树脂就会释放纯化了的DNA。

经胶回收试剂盒纯化的DNA的纯度与密度梯度离心制备的DNA相仿。500bp以上片段，回收率90%以上，200～500bp回收率80%以上，100～200bp回收率60%。可回收单链、双链DNA片段以及环状质粒DNA。

1.离心柱:100个（含树脂）

2.溶液A:100mL 6mol/L NaClO₄，0.03mol/L NaAc，pH 5.2，少量酚红

3.溶液B:1.5mL 3mol/L NaAc

4.溶液C:60mL用时加入70mL无水乙醇，充分混匀

5.溶液D:6mL TE缓冲液

三、器材和试剂

离心机，1.5毫升离心管、移液器吸嘴、微量移液器、水浴锅、漩涡振荡器、水平电泳槽、电泳仪、制胶槽、加样梳。

DNA片段回收试剂盒（鼎国公司）、无菌去离子水、PCR产物、琼脂糖（Spanish，鼎国公司）、1×TAE电泳缓冲液、GoldView^TM核酸染料（赛百盛公司）、6×DNA上样缓冲液、DL2000 DNA Marker。

四、操作步骤

1.在紫外观测仪中切取含DNA片段的琼脂糖凝胶（100～300mg），按每100mg胶加300μL溶液A的比例加入溶液A。

2.65℃水浴5～10min，胶完全熔化即可，其间可振荡助熔2～3次，待熔化后置室温加入15μL溶液B，充分混匀。

［注］　如果体积大于500μL，可适当增加熔胶时间。

3.将溶液置于离心柱中，静置2min，13 000r/min离心20～30s，若一次加不完，可分两次离心。

4.倒掉液体，加入500μL溶液C于离心柱中13 000r/min离心20～30s，弃液体。

5.重复步骤4。

6.13 000r/min再次离心1min，甩干剩余液体以除去残余酒精。

7.将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖，放置5～10min，使乙醇挥发殆尽。

8.加入20～30μL溶液D或无菌去离子水（50℃水浴），静置2min。

9.13 000r/min离心1min，管底溶液即为所需DNA。将DNA储存于-20℃可长期保存。

五、注意事项

1.电泳缓冲液可为TAE或TBE，但TAE效果最佳。

2.影响回收率和回收质量最主要因素是pH和切胶薄厚，尽可能切除不含DNA的凝胶。

3.水浴温度范围为50～65℃即可，溶液D的用量根据实验对DNA浓度要求而定。

六、实验结果及分析

PCR产物柱纯化后电泳图片（参考图3-3）。

图3-3　PCR产物柱纯化后电泳图

七、参考文献

［1］　鼎国生物技术有限公司《DNA片段回收试剂盒使用说明书》，2009。

［2］　Daniel Tillett，Brett A Neilan，1999.An improved method for the purification of large DNA fragment from agarose gel using wizard plus SV columns.Anal Biochem，269:218-219.

［3］　Elvina M atitashvili，Boris Zavizion，1997.One-Tube extraction of DNA or RNA fro agarose gel.Anal Biochem，246:260-262.