动物肝脏的提取与纯化

实验六　动物肝脏DNA的提取与纯化

【实验目的】

1．了解从动物组织中提取和纯化DNA的原理。

2．掌握从动物组织中提取和纯化DNA的方法。

【实验原理】

生物体组织细胞中的大部分脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)与蛋白质结合，以核蛋白——脱氧核糖核蛋白(DNP)和核糖核蛋白(RNP)的形式存在，这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0．14 mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%(几乎不溶);但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0．5 mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1 mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍(溶解度很大)。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。

将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠(SDS)处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA粗制品。为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入乙二胺四乙酸(EDTA)。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。

【实验器材】

捣碎机、离心机、手术剪、离心管、刻度吸管、烧杯(100 ml)、玻棒、新鲜动物肝脏、石英比色皿、紫外分光光度计、微量移液器等。

【药品试剂】

1．5 mol/L NaCl溶液:称取NaCl146．15 g，溶于蒸馏水并稀释到500 ml。

2．0．14 mol/L NaCl-0．15 mol/L EDTA-Na₂溶液:称取NaCl 4．09 g及EDTA-Na₂27．9 g溶于蒸馏水稀释到500 ml。

3．25%SDS溶液:称取SDS 25 g，溶于45%乙醇100 ml中。

4．苯酚氯仿异戊醇混合液:苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1(V∶V)。

5．核糖核酸酶A(RNase A)。

6．95%乙醇、80%乙醇。

7．二苯胺试剂:1 g二苯胺溶于100 ml冰乙酸，再加60%过氯酸10 ml，混匀。临用前加入1 ml 1．6%乙醛溶液。

8．0．5 mol/L过氯酸溶液:将过氯酸(70%)5 ml用蒸馏水稀释至55 ml，得1 mol/L过氯酸。将1 mol/L过氯酸25 ml用蒸馏水稀释至50 ml，即得0．5 mol/L过氯酸溶液。

9．TE缓冲液、DNA标准液、0．16%乙醛。

【实验方法】

1．DNA的提取:

(1)称取新鲜动物的肝脏(如猪肝)约10 g，于研钵中，在冰浴中剪碎，加2倍组织重的冷的0．14 mol/L NaCl-0．15 mol/L EDTA溶液(约20 ml)研磨成浆状，得匀浆液。

(2)将匀浆液(除去组织碎片)于3000 r/min离心10分钟，弃去上清液，收集沉淀(内含DNP)，沉淀中加两倍体积的冷的0．14 mol/L NaCl-0．15 mol/L EDTA溶液，搅匀，如前离心，重复洗涤2～3次。所得沉淀为DNP粗制品，移至烧杯中。

2．DNA的纯化:

(1)取粗品DNA，加入5μl RNA酶，用玻璃棒慢慢搅拌20分钟。

(2)向沉淀中加入冷的0．14 mol/LNaCl-0．15 mol/L EDTA溶液，使总体积达到20 ml，在缓慢搅拌的同时滴加25%的SDS溶液1.5 ml，边加边搅拌，此步骤使核酸与蛋白质分离。

(3)加入5 mol/L NaCl溶液5 ml，使NaCl最终浓度约为1 mol/L，搅拌10分钟(速度要慢)。溶液变得黏稠并略带透明。

(4)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，于冰浴中搅拌20分钟，3000 r/min离心10分钟。分层，上层为水相(含DNA钠盐)，中层为变性的蛋白沉淀，下层为苯酚/氯仿/异戊醇混合液。

(5)用吸管小心地吸取上层水相，弃去沉淀，再在相同条件下重复抽提2～3次。

(6)取上清液放入干燥小烧杯中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。加乙醇时，用滴管吸取乙醇，边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动，随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质，并能逐步缠绕于玻璃棒上，此时玻璃棒搅动的目的在于把黏稠丝状物缠在玻璃棒上，直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。

(7)用2 ml 80%乙醇洗涤沉淀物1次。

(8)室温干燥，直到附于玻璃棒的残余液滴干净。

(9)用1～2 ml TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或－20℃保存备用。

【注意事项】

1．选择的实验材料要新鲜，处理时间不宜过长。

2．提取和纯化的DNA不纯，加溶解液太少使浓度过大，或者沉淀物太干燥，这些因素都会导致提取的DNA不易溶解。

3．酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取，表明含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。

【思考题】

1．核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质?

2．DNA与RNA通过什么样的方法分开的?