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动物肝脏的提取与纯化

时间:2021-02-11 理论教育 版权反馈
【摘要】:实验六 动物肝脏DNA的提取与纯化1.了解从动物组织中提取和纯化DNA的原理。因此,可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。为了防止DNA酶解,提取时加入乙二胺四乙酸。所得沉淀为DNP粗制品,移至烧杯中。黏稠丝状物即是DNA。2.提取和纯化的DNA不纯,加溶解液太少使浓度过大,或者沉淀物太干燥,这些因素都会导致提取的DNA不易溶解。
动物肝脏的提取与纯化_生物化学实验指导

实验六 动物肝脏DNA的提取与纯化

【实验目的】

1.了解从动物组织中提取和纯化DNA的原理。

2.掌握从动物组织中提取和纯化DNA的方法。

【实验原理】

生物体组织细胞中的大部分脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)与蛋白质结合,以核蛋白——脱氧核糖核蛋白(DNP)和核糖核蛋白(RNP)的形式存在,这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中,DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低,当NaCl浓度达到0.14 mol/L时,DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%(几乎不溶);但当NaCl浓度继续升高时,DNP的溶解度又逐渐增大,当NaCl浓度增至0.5 mol/L时,DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度,当NaCl浓度继续增至1 mol/L时,DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍(溶解度很大)。而RNP则不一样,它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此,可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。

将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠(SDS)处理,DNA即与蛋白质分开,可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去,而DNA溶于溶液中,加入适量的乙醇,DNA即析出,进一步脱水干燥,即得白色纤维状的DNA粗制品。为了防止DNA(或RNA)酶解,提取时加入乙二胺四乙酸(EDTA)。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。

【实验器材】

捣碎机、离心机、手术剪、离心管、刻度吸管、烧杯(100 ml)、玻棒、新鲜动物肝脏、石英比色皿、紫外分光光度计、微量移液器等。

药品试剂

1.5 mol/L NaCl溶液:称取NaCl146.15 g,溶于蒸馏水并稀释到500 ml。

2.0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA-Na2溶液:称取NaCl 4.09 g及EDTA-Na227.9 g溶于蒸馏水稀释到500 ml。

3.25%SDS溶液:称取SDS 25 g,溶于45%乙醇100 ml中。

4.苯酚氯仿异戊醇混合液:苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1(V∶V)。

5.核糖核酸酶A(RNase A)。

6.95%乙醇、80%乙醇。

7.二苯胺试剂:1 g二苯胺溶于100 ml冰乙酸,再加60%过氯酸10 ml,混匀。临用前加入1 ml 1.6%乙醛溶液。

8.0.5 mol/L过氯酸溶液:将过氯酸(70%)5 ml用蒸馏水稀释至55 ml,得1 mol/L过氯酸。将1 mol/L过氯酸25 ml用蒸馏水稀释至50 ml,即得0.5 mol/L过氯酸溶液。

9.TE缓冲液、DNA标准液、0.16%乙醛。

【实验方法】

1.DNA的提取:

(1)称取新鲜动物的肝脏(如猪肝)约10 g,于研钵中,在冰浴中剪碎,加2倍组织重的冷的0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液(约20 ml)研磨成浆状,得匀浆液。

(2)将匀浆液(除去组织碎片)于3000 r/min离心10分钟,弃去上清液,收集沉淀(内含DNP),沉淀中加两倍体积的冷的0.14 mol/L NaCl-0.15 mol/L EDTA溶液,搅匀,如前离心,重复洗涤2~3次。所得沉淀为DNP粗制品,移至烧杯中。

2.DNA的纯化:

(1)取粗品DNA,加入5μl RNA酶,用玻璃棒慢慢搅拌20分钟。

(2)向沉淀中加入冷的0.14 mol/LNaCl-0.15 mol/L EDTA溶液,使总体积达到20 ml,在缓慢搅拌的同时滴加25%的SDS溶液1.5 ml,边加边搅拌,此步骤使核酸与蛋白质分离。

(3)加入5 mol/L NaCl溶液5 ml,使NaCl最终浓度约为1 mol/L,搅拌10分钟(速度要慢)。溶液变得黏稠并略带透明。

(4)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液,于冰浴中搅拌20分钟,3000 r/min离心10分钟。分层,上层为水相(含DNA钠盐),中层为变性的蛋白沉淀,下层为苯酚/氯仿/异戊醇混合液。

(5)用吸管小心地吸取上层水相,弃去沉淀,再在相同条件下重复抽提2~3次。

(6)取上清液放入干燥小烧杯中,加入2倍体积预冷的95%乙醇。加乙醇时,用滴管吸取乙醇,边加边用玻璃棒慢慢顺一个方向在烧杯内转动,随着乙醇的不断加入可见溶液出现黏稠状物质,并能逐步缠绕于玻璃棒上,此时玻璃棒搅动的目的在于把黏稠丝状物缠在玻璃棒上,直至再无黏稠丝状物出现为止。黏稠丝状物即是DNA。

(7)用2 ml 80%乙醇洗涤沉淀物1次。

(8)室温干燥,直到附于玻璃棒的残余液滴干净。

(9)用1~2 ml TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或-20℃保存备用。

【注意事项】

1.选择的实验材料要新鲜,处理时间不宜过长。

2.提取和纯化的DNA不纯,加溶解液太少使浓度过大,或者沉淀物太干燥,这些因素都会导致提取的DNA不易溶解。

3.酚/氯仿/异戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取,表明含高浓度的DNA,可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。

【思考题】

1.核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质?

2.DNA与RNA通过什么样的方法分开的?

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