实施基因工程的第一步就是获取目的基因，如植物的抗病基因、种子的贮藏蛋白基因等。一般来说，目的基因分离的策略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后采用合适的方法从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类为利用PCR（聚合酶链式反应）扩增技术或化学合成法体外直接合成目的基因。
图7.5 基因工程简单示意图（Yashon R K，Cummings M R，2009）
基因文库法分离基因。包括基因组文库（含有全部基因）和cDNA文库（含有全部蛋白质编码基因）。基因组文库是从生物组织细胞中提取出全部DNA，用物理方法或酶法，将DNA降解成预期大小的片段，将这些片段与载体连接后转入受体细菌或细胞，每个细胞接受一个重组DNA分析，并进行扩增繁殖，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体。cDNA文库则是从组织细胞中提取出全部的mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA并繁殖扩增，获得含有细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合。文库构建好后，从文库中获得目的基因，若分离已知序列的基因，可通过核酸杂交法（菌落原位杂交）（见图7.6）、PCR筛选法（PCR扩增筛选阳性克隆）和表达筛选法来获得；若分离未知基因，可通过染色体步移（chromosome walking）和杂交捕捉和释放法获得。染色体步移可有效地获得与已知序列相邻的未知序列。杂交捕捉转译即用混合的cDNA克隆和mRNA杂交，将mRNA进行体外翻译，翻译由于杂合分子的形成而受到抑制。在此基础上，通过对混合cDNA克隆进行分组，并反复进行杂交捕捉转译，可鉴定出抑制某一特异蛋白转译的cDNA克隆。若在杂交后，用磁珠分离等方式提取cDNA-mRNA杂合分子，然后释放其中的mRNA，从而鉴定编码该蛋白的cDNA克隆，则称为杂交释放转译。
图7.6 核酸杂交-菌落原位杂交
PCR法克隆目的基因。使用PCR法克隆基因的前提条件是已知待扩增目的基因两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双向引物。PCR方法是模拟体内的DNA复制，首先加热使DNA双链变性为单链，然后退火（降温）至变性温度点以下，此时单链DNA与加入的小片段DNA引物复性，随后适宜温度下，在耐热的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）作用下自引物延伸子链。不断重复高温变性、低温退火、适温延伸3个步骤，使样品DNA大量扩增（见图7.7）。
图7.7 PCR扩增目的基因
化学合成法合成目的基因。常用的方法包括磷酸二酯法（见图7.8）、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化合成法。化学合成法主要用于基因较小，核苷酸序列已知的基因的合成。
图7.8 磷酸二酯法合成过程
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