血凝素基因的回收纯化

实验五　血凝素基因的回收纯化

一、实验目的

掌握用吸附柱或者玻璃粉回收纯化DNA片段的方法。

二、实验原理

在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其他生物分子分离。

玻璃粉或硅胶基质被证实为一种有效的核酸吸附剂。在一定浓度的盐溶液中，核酸可被吸附至Ez-Resin等硅胶基质或者3S column等玻璃基质上，碘化钠或高氯酸钠可促进DNA与玻璃基质的结合。然后用洗脱液洗脱，可获得纯化的核酸，获得高产量的DNA。

三、实验材料及器械

(1)PCR产物。

(2)吸附柱、收集管(2ml)、tip头、Eppendorf管、离心机、水浴锅、微量加样器。

(3)溶胶液、洗脱缓冲液、漂洗液(浓缩液)(使用前先在15ml漂洗液中加入60ml无水乙醇)、3mol/L醋酸钠(pH5.2)。

四、实验步骤

第一次使用前先在15ml漂洗液中加入60ml无水乙醇。

1.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，并放入干净的离心管中，称取重量。

2.向胶块中加入3倍体积55℃预热的溶胶液(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，可加入300μl溶胶液)，50～55℃水浴放置10min，其间不断温和地摇动离心管，以确保胶块完全溶解。

注意事项:

溶胶时，如果溶胶液变为红色(正常情况下为淡黄色)，可向含有DNA的溶胶液中加3mol/L醋酸钠(pH5.2)将溶胶液颜色调为淡黄色，否则将会影响DNA与吸附柱的结合，影响回收效果。

3.将上一步所得溶液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，13000r/min离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

注意事项:

胶块完全溶解后最好将溶胶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。

4.向吸附柱中加入700μl漂洗液(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，13000r/min离心30～60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

5.向吸附柱中加入500μl漂洗液，13000r/min离心30～60s，倒掉废液。洗涤两次。

6.12000r/min离心1min。尽量去除漂洗液，以免残留乙醇影响实验。

7.取出吸附柱，放入一个干净的1.5ml Ep管中，加入30～60μl的洗脱液，室温放置2min，12000r/min离心1min;收集离心液。 －20°C保存备用。

五、方法评注

目前，回收纯化DNA片段的方法很多，其中柱回收法回收纯化DNA片段可谓目前最简单快速的回收方法，全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继分子生物学实验(如酶切、连接等)。但是这个方法不适合用于大片段的回收。回收纯化DNA片段的方法还有:

(1)玻璃奶回收法:该方法可以根据每次回收实验时预期回收量来调整纯化填料的量，使得实验不受限于柱子的载量，也不会造成浪费。(具体操作见附录)

(2)低熔点琼脂糖法:这是传统的操作方法之一，一般用低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，65℃融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。

(3)透析带电洗脱法:琼脂糖电泳后切下的条带放在充满TAE的透析带中再电泳一段时间，让DNA出凝胶，进入到透析袋中的溶液，然后再反向电泳一会儿，将附在透析带上的DNA回到透析袋中的溶液中，取溶液部分用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。

(4)DEAE纤维素膜纸片法和其他改良法:早期实验室最常用方法之一。将DEAE纤维素膜裁成小条，并活化。琼脂糖电泳，在目的条带前切一个小口，将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口(注意不能留气泡)，继续电泳，这样，DNA就附着到DEAE纤维素膜上，取出膜片，转移到离心管中，加缓冲液65℃保温洗脱，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。

六、技术要点

现在我们常用的分离鉴定DNA的EB染料法是由冷泉港实验室的Joseph Sambrook和Phillip Sharp在1973年发明的。电泳时我们应注意:

(1)琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见表5-1所示。

表5-1　不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围

(2)电泳时应置于稳压档，电泳时电压设置一般为100V出孔，出孔后电压设置小于5V/cm (电极间的最小路径)。

注意事项:

随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。

(3)溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。

附:玻璃珠吸附法回收DNA

一、实验材料及器械

PCR产物、玻璃珠、Wash Buffer、Binding Buffer (pH 8.0)、无菌蒸馏水、水浴锅。

二、实验步骤

(1)制备一块凝胶，电泳剩余的PCR产物，从琼脂糖凝胶上切下目的片段的胶条，置于1.5ml微量离心管中，加入3倍体积的Binding Buffer，50℃保温10min，每隔2～3min轻摇离心管，使胶完全溶化。

(2)加入5μl玻璃珠，颠倒混匀，室温放置10min，并间隔2 ～3min混匀一次，12000r/min离心1min，弃去上清液。

(3)加入750μl Wash Buffer，充分混匀，反复倒置离心管3～5min，离心1min，弃去上清液。

(4)重复第3步1次，空干残液，室温放置。

(5)加入20μl无菌蒸馏水(pH 8.0)，混匀，50℃水浴5min，12000r/min离心1min，回收上清液备用。

(6)取2μl电泳检测回收片段。