-插入位点基因的克隆和鉴定

-插入位点基因的克隆和鉴定_-_植物发育生物学实

实验十　T-DNA插入位点基因的克隆和鉴定——Tail-PCR

克隆功能基因是植物发育分子生物学研究中的重要基础。基因克隆中常用的图位克隆、转座子标签或T-DNA标记等方法都要依靠染色体步移技术。染色体步移(chromosome walking)是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列核苷酸组成的方法和过程。但是基于细菌人造染色体(bacterial artificial chromosomes，BAC)重叠群的染色体步移方法比较繁琐，并且费时较长，而基于PCR的染色体步移技术则相对比较简便，得到了广泛应用。

热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR，简称TaiL-PCR)是一种建立在PCR反应基础上，用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术。该技术由Liu和Whitter于1995年首先研究并报道。该技术以基因组DNA为模板，使用高退火温度的长特异引物和短的低退火温度的简并引物，通过特殊的热不对称(高严谨性PCR和低严谨性PCR交替)循环程序，有效扩增特异产物。可以应用于从酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosome; YAC)和BAC克隆中分离获得插入末端的DNA序列和拟南芥T-DNA侧翼序列。近年来，该法已被研究者广泛应用，成为分子生物学研究中常用的克隆基因侧翼序列的技术。

【实验目的】

1.掌握热不对称交错PCR的原理。

2.掌握利用Tail-PCR技术获得T-DNA插入位置DNA序列的方法。

【实验原理】

Tail-PCR技术原理是:以基因组DNA作为模板，利用依照目标序列旁的已知序列设计的3个较高退火温度的嵌套特异性引物(special primer，SP)和一个较短且Tm值较低的随机简并(arbitrary degenerate，AD)引物组合，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。

由一个特异性引物和一个简并引物相组合构成的PCR反应叫做“半特异性PCR”。这种反应会产生3种不同类型的产物:由特异性引物和简并引物扩增出的产物;由同一特异性引物扩增出的产物;由同一简并引物扩增出的产物。在Tail-PCR反应中，后两种非目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。

Tail-PCR一般反应的步骤如图1-6所示。各实验室可根据自己的实际需要对其中的步骤进行适当的完善和修改。

Tail-PCR中的第1轮PCR反应包括5次高严谨性反应、1次低严谨性反应、10次较低严谨性反应和12次热不对称的超级循环。经过上述一系列的反应得到了不同浓度的3种类型产物:特异性产物(Ⅰ型:特异引物和AD引物的扩增产物)和非特异性产物(Ⅱ型:特异引物自身的扩增; III型: AD引物自身的扩增)。

第2轮反应则将第1轮反应的产物稀释1000倍作为模板(在实际应用中常常根据需要稀释200倍或者100倍)，高退火温度的特异引物SP2与相应的AD引物结合，通过10次热不对称的超级循环，使特异性的产物被选择性扩增。

第3轮反应是将第2轮反应的产物稀释1000倍作为模板(在实际应用中常常根据需要稀释200倍或者100倍)，特异引物SP3与相应AD引物组合，一般采用普通PCR反应或热不对称的超级循环反应程序。此时，目的片段便得到进一步的特异扩增，从而获得与已知基因序列邻近的目标序列。

图1-6　Tail-PCR的一般步骤

Tail-PCR中引物的设计原则:根据已知序列设计3个与其边界距离不等的嵌套的特异性引物，特异性引物的长度约为20bp，Tm一般为58～68℃。再根据普遍存在的蛋白质的保守氨基酸序列设计一系列简并引物，简并引物相对较短，长度为14bp，Tm 30～48℃。除3'端的3个碱基以外，其他位置的碱基一般包含简并核苷酸。反应体系中，特异性引物的浓度与普通PCR相同，简并引物的浓度要高，一般为2.5～5μmol/L，以满足引物的结合效率。

【实验材料】

拟南芥T-DNA插入突变体植株。

【实验器材】

PCR仪，电泳仪，研钵，离心机等。

【药品试剂】

1.抽提缓冲液(pH 7.5) 1L: 0.35mol/L葡萄糖(69.36g); 0.1mol/L Tris-HCl(12.44g); 0.005mol/L Na₂ EDTA(1.86g); 2%(W/V) PVP K-30(20g); 0.1% DIECA(2g)，使用前加β-巯基乙醇至0.2%，pH值调至7.5。

2.抽提裂解液(pH 8.0) 1 L: 0.1mol/L Tris-HCl(12.44g); 1.4mol/L NaCl(81.816g); 0.02mol/L Na₂ EDTA(7.45g); 2% CTAB(20g); 0.1% DIECA(1g); 2% PVP K-30(20g)，加0.2%β-巯基乙醇后调pH值至8.0。

3.AD引物:

AD2: NGTCGASWGANAWGAA 128-fold degenerate(Liu et al.，1995)

AD1: TGWGNAGSANCASAGA 128-fold degenerate(Liu and Whittier，1995)

AD2: AGWGNAGWANCAWAGC 128-fold degenerate(Liu and Whittier，1995)

AD5: STTGNTASTNCTNTGC 256-fold degenerate(Tsugeki et al.，1996)

AD1: NTCGASTWTSGWGTT 64-fold degenerate(Liu et al.，1995)

AD3: WGTGNAGWANCANAGA 256-fold degenerate(Liu et al.，1995)

S=G or C; W= A or T; N=A，C，G or T。

4×AD引物中个种引物的浓度: 64 fold degenerate的引物为8μmol/L; 128 fold degenerate的引物浓度为12μmol/L; 256 fold degenerate的引物浓度为16μmol/L。将各个引物按照上述终浓度的需要稀释并混合，4×AD引物保存在－20℃。

4.T-DNA序列的特异引物:

右引物:

RB1 ATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATG

RB2 GTATGTTGTGTGGAATTGTGATCGGATAAC

RB3 TAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC

左引物:

LB1 GCCTTTTCAGAAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC

LB2 GCTTCCTATTATATCTTCCCAAATTACCAATACA

LB3 TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC

5.乙醇、异丙醇、10mmol/L Tris-EDTA缓冲液(pH 8.0)、灭菌水、DNA聚合酶(Taqase)及缓冲液、dNTP等。

【实验方法】

一、植物基因组DNA的提取(CTAB法)

1.取幼嫩叶片于研钵中，加预冷的抽提缓冲液，迅速充分研磨。

2.用剪宽了的200μl枪头将研磨液吸入1.5ml离心管中，4℃下12000r/min离心10分钟。

3.取上清液至新的1.5ml离心管中，加400μl预热到65℃的裂解缓冲液，并迅速搅拌均匀，65℃水浴中30分钟。每隔10分钟轻轻摇动一次。

4.加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻上下颠倒混匀至溶液成一相。

5.室温12000r/min离心10分钟。

6.用剪宽了的200μl枪头取上清液至新管，重新加入等体积的氯仿:异戊醇(24∶1)，轻摇混匀。

7.室温12000r/min离心10分钟。取上清液至新管，加入2/3体积冰冷的(－20℃)异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，这时会出现絮状的DNA沉淀。－20℃冷冻30分钟。

8.将DNA转移至新管，用75%乙醇浸泡以洗掉盐离子和去除杂质，2～3次。倒掉乙醇，将DNA风干，用200μl pH 8的10 mmol/L Tris-EDTA(TE)缓冲液溶解。

9.DNA质量的电泳检测。吸取2μl的DNA在1%的琼脂糖上检测。

【注意事项】

CTAB法提取基因组DNA原理: CTAB是一种非离子去污剂。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐(大于0.7mmol/L)浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度(0.1～0.5mmol/L NaCl)下CTAB-核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清液后，CTAB-核酸复合物再用75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。

二、Tail-PCR

步骤参照《拟南芥实验手册》(Weigel and Glazebrook，2004)。

1.在冰上将Taq聚合酶、dNTPs、MgCl₂、特异引物和4×AD引物混合物按照表1-2的比例加入PCR管中，总体积为20μl。

表1-2　Tail-PCR反应中第一轮PCR反应体系

2.加入5μl稀释后的基因组DNA(稀释后的浓度为0.1～0.2ng/μl)。

3.开始第一轮PCR反应:

Step 1= 4℃2分钟

Step 2= 93℃1分钟

Step 3= 95℃1分钟

Step 4= 94℃30秒

Step 5= 62℃1分钟

Step 6= 72℃150秒

Step 7=回到Step 4并再重复4个循环

Step 8= 94℃30秒

Step 9= 25℃3分钟

Step 10=每秒升高0.2℃，一直到72℃

Step 11= 72℃150秒

Step12= 94℃10秒

Step 13= 68℃1分钟

Step 14= 72℃150秒

Step 15= 94℃10秒

Step 16= 68℃1分钟

Step 17= 72℃150秒

Step 18= 94℃10秒

Step 19= 44℃1分钟

Step 20= 72℃150秒

Step 21=回到Step12并再重复14个循环

Step 22= 72℃5分钟

Step 23= 4℃保持

4.将第一轮PCR的产物混匀后在离心机上分离，然后置于冰上备用。

5.按照表1-3将PCR混合物加到PCR管中，准备进行第二轮的扩增。

表1-3　Tail-PCR反应中第二轮PCR反应体系

续表

每20μl第二轮反应混合物中加入4μl稀释200倍后的第一轮PCR产物。

6.开始第二轮PCR反应:

Step 1= 4℃2分钟

Step 2= 94℃10秒

Step 3= 64℃1分钟

Step 4= 72℃150秒

Step 5= 94℃10秒

Step 6= 64℃1分钟

Step 7= 72℃150秒

Step 8= 94℃10秒

Step 9= 44℃1分钟

Step 10= 72℃150秒

Step 11=回到Step 2并再重复11个循环

Step 12= 72℃5分钟

Step 13= 4℃保持

7.将第二轮PCR的产物混匀后在离心机上稍离心片刻，然后置于冰上备用。

8.按照表1-4的浓度将PCR混合物加到PCR管中，准备进行第三轮的扩增。

表1-4　Tail-PCR反应中第三轮PCR反应体系

每50μl第三轮反应混合物中加入5μl稀释100倍后的第一轮PCR产物。

9.第三轮PCR反应:

Step 1= 4℃2分钟

Step 2= 94℃10秒

Step 3= 44℃1分钟

Step 4= 72℃150秒

Step 5=回到Step 2并再重复19个循环

Step 6= 72℃5分钟

Step 7= 4℃保持

10.2% DNA凝胶电泳分析第二轮和第三轮PCR产物。

【思考题】

1.Tail-PCR技术的原理是什么?

2.Tail-PCR技术在植物发育生物学研究中有哪些应用?