克隆化基因的表达

第五节　克隆化基因的表达

克隆化基因的表达是指被克隆入某一载体中的目的基因经转录和翻译后产生蛋白质的过程。基因工程的最终目的就是在一个合适的表达系统中高效表达人类所需的活性蛋白。基因表达的产物蛋白质以融合、非融合状态存在；可以是可溶性的或不溶性蛋白；可以分泌到胞外、定域到细胞周质或细胞质，经分离、纯化、鉴定以后，得以应用。

一、体外表达系统

一个完整的表达系统由表达载体、目的基因和宿主细胞共同构成。不同的载体有相应的宿主细胞。在表达某一目的基因时，首先要搞清它是原核基因还是真核基因，然后选择合适的表达载体以及受体细胞进行表达。一般说来，原核基因选择在原核细胞中表达，而真核基因既可选择真核细胞，也可选择原核细胞进行表达。

表达载体在体外表达系统中扮演着十分重要的角色，负责克隆目的基因、指导目的基因在宿主体内的转录和翻译。因而表达载体中除含有目的基因外，还应引入与目的基因相匹配并为受体细胞识别的转录元件、翻译元件与调控序列。为了能高效表达，表达载体的必要条件是：①应有很强的启动子能为宿主的RNA聚合酶识别。而且最好是能被诱导的，因为一般不受调控的转录不但效率不高，而且外源产物给细胞造成过重负担，在产物对细胞有毒害时更为如此。②有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录外源基因而不去转录其他的DNA，同时强终止子产生的mRNA亦较稳定。③所产生的mRNA应具有宿主识别的翻译信号。如在大肠埃希菌宿主中应有合适的SD序列、ATG起始密码子等。表达载体常见的结构组成示意图如图3－7。

常用的表达载体有：①质粒载体如pKK、PET系列及pBV220质粒等；②哺乳动物细胞的载体，如SV40衍生载体、反转录载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体等；③酵母质粒载体；④昆虫杆状病毒载体等。

良好的表达系统还需选择合适的宿主细胞。与上述载体对应的宿主细胞分别为大肠埃希菌、哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞。

在基因表达方面，真核细胞与原核细胞相比在翻译加工方面具有明显的优点，例如蛋白质中二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成等。但也有明显不足，除了基因转移较困难外，外源基因整合到细胞染色体上的位置与拷贝数等因素不易控制，真核细胞中的表达水平也要比原核细胞低得多，而且成本高，操作条件严格而复杂。因此，对不需要精确的翻译后加工的产物来说，即真核基因在原核细胞中表达产物的生物学活性与在真核细胞中无差别时，通常选择原核细胞进行表达。不过，当外源基因在大肠埃希菌中以较高的水平表达时，表达产物多以无活性的不可溶的包涵体形式存在，虽然比较稳定，但须经一系列处理后才能获得有活性的产物。

二、体外表达的过程

1.DNA复制　由DNA复制起始位点ori和抗药性基因（如氨苄西林抗性基因Ap^r、四环素抗性基因Tc^r等）来完成。松弛型ori位点能使载体借用宿主的DNA复制体系大量复制载体DNA，同时克隆的目的基因亦得以大量复制，为基因的高水平转录提供足够多的模板。载体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在有抗生素的培养条件下正常生长，这样就筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。

2.目的基因的转录　目的基因转录系统包含启动子、阻遏物基因和转录终止子。启动子是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导宿主转录目的基因的DNA顺序，位于目的基因的上游。常用的有乳糖启动子（Plac）、色氨酸启动子（Ptrp）、两者杂合的启动子（Ptac）、λ噬菌体双向启动子（λP_RP_L）、T7启动子、脂蛋白基因启动子（PIpp）等。表达载体大多选用在宿主中起始功能强的强启动子，目的基因在启动子的指导下转录出大量的mRNA，为后一步的蛋白质翻译提供尽可能多的模板。阻遏物基因产物对启动子起始功能产生抑制，适当的诱导条件可使阻遏物失活，启动子功能重新恢复。阻遏物基因产物是一种控制启动子功能的蛋白质，通过它使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，保证转录有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录时机尤其重要。转录终止子是一段终止RNA聚合酶转录的DNA顺序，使转录在目的基因之后立刻停止，避免作多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，特别是在原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。

3.蛋白质的翻译　蛋白质翻译系统包含核糖体识别位点（SD顺序）、翻译起始密码子和翻译终止密码子。SD顺序与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合，mRNA翻译模板与核糖体结合，其亲和力的高低对翻译效率极重要。起始密码子是翻译的起始位点。通常为AUG，编码Met（甲硫氨酸）。终止密码子与核糖体相遇能使核糖体从mRNA模板上脱落，终止蛋白质的翻译过程。

在进行基因表达时，必须保持目的基因的正确翻译相位，才能得到目的基因产物，尤其是在采用不完整的目的基因或在作融合基因时，更应注意这点。可通过用工具酶切除去或添加几个核苷酸、引入相宜的接头以及使用相应的载体等方法来达到。

三、外源基因在大肠埃希菌中的高效表达

大肠埃希菌是迄今为止研究的最为详尽的原核细菌。其细胞结构简单、生理代谢途径以及基因的表达调控机制都相对较为清楚，并且繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行遗传操作和大规模培养，因此广泛用于分子生物学研究的各个领域，如基因分离扩增、DNA序列分析、基因表达产物功能鉴定等。DNA重组技术首先在细菌中获得成功并得到广泛应用。越来越多的真核生物基因已在大肠埃希菌中获得高效表达，目前已经实现商品化的基因工程产品中，大部分是由重组大肠埃希菌生产的。利用DNA重组技术构建大肠埃希菌工程菌大规模生产真核生物基因，尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。

（一）在大肠埃希菌中表达的外源基因

在蛋白质翻译时，是由带有相应反密码子的tRNA将氨基酸引导到mRNA上的，在哺乳动物细胞中各种tRNA的含量差别不太明显，但在原核生物中tRNA种类差异很大，造成原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有不同程度的差异性，这就是密码子的偏爱性。因此，外源基因尤其是哺乳动物基因在大肠埃希菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠埃希菌中获得最佳表达：①采用外源基因全合成的方法，按照大肠埃希菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应密码子，重组人胰岛素、干扰素和生长激素在大肠埃希菌中的高效表达均采用了这种方法；②对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高而本身相对分子质量又较大的外源基因而言，则可以选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略。

外源基因必须处在表达载体的正确的阅读框架，否则会导致编码错误。因此，在插入外源基因的时候一定要仔细比对基因插入的位置。目前，很多公司出售的表达载体都是成套的，每套包括3个载体。这3个载体的唯一区别就是，多克隆位点与起始密码子之间的距离分别相差一个碱基对。因此，必定有一个而且也只能有一个载体能将目的序列处于正确的位置。

如果所表达的是真核基因还应去除内含子和信号肽编码序列，因为大肠埃希菌缺乏对真核基因中内含子的剪接功能。

（二）外源蛋白在大肠埃希菌中的表达形式

外源基因在大肠埃希菌中的表达产物可以可溶性的形式或不溶性的包涵体颗粒。

1.可溶性的蛋白表达产物　所表达的蛋白质是以可溶性形式存在于细菌细胞质中。这种表达产物较易有生物学活性。但是，这种形式的表达效率一般不是很高，因大量累积的异源蛋白极易被细菌的蛋白水解酶所降解，不利于表达产物的积累，严重影响目标产物的最终收率。

另外，可溶性外源蛋白表达产物的回收和纯化比较复杂。如果没有针对所表达出的蛋白质的特异性亲和方法，从细菌本身大量的可溶性蛋白质中分离纯化目的蛋白是非常不容易的。

2.包涵体型异源蛋白的表达　在某些生长条件下，大肠埃希菌将所表达的外源蛋白质致密地集聚在细胞内，或被膜包裹，或形成无膜裸露结构，在生长的大肠埃希菌细胞中可直接用相差显微镜观察到，这种结构称为包涵体（inclusion bodies，IB），也称为光折射体。有些包涵体本身虽然并不折射光，却能清晰地出现在细胞的电子显微镜照片中。由高效表达质粒构建的大肠埃希菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下以包涵体的形式存在于细菌细胞内。

包涵体基本上由蛋白质组成，其中绝大部分是克隆外源基因的表达产物，它们具有正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错误的，分子紧密积聚成颗粒状，因而没有生物活性，在水溶液中很难溶解，只有在高浓度的变性剂（如盐酸胍或尿素）溶液中才能形成均相。

以包涵体形式表达重组异源蛋白的表达量很高，可以对抗细菌的蛋白水解酶的作用，有利于所表达的蛋白产物的富集，尤其是当表达的蛋白产物对细菌是有毒甚至是致死性的作用的时候。其另一个显著的优点是简化了外源基因表达产物在大肠埃希菌细胞内的分离纯化程序，因为包涵体极难溶于水且其密度远大于其他细胞碎片结合蛋白，通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。

但是，包涵体颗粒形式的蛋白质产物是没有生物学活性的，要用高浓度的变性剂溶解，再通过透析超滤或稀释的方法大幅度降低变性剂的浓度使其复性才能得到可溶解性蛋白质，这就增加了操作难度，同时也会造成表达产物蛋白质的不同程度的损失。另外，经过变性复性处理后的蛋白质不一定能完全恢复生物学活性。这些处理工艺使蛋白质制备成本上升，尤其在重组异源蛋白的大规模生产过程中，这个缺陷更为明显。

（三）大肠埃希菌表达载体的构建策略

根据表达载体结构与作用过程不同，可将表达载体分为完整蛋白表达载体和融合蛋白表达载体，经翻译得到的蛋白质分为非融合蛋白和融合蛋白。

1.完整蛋白表达载体　目的基因直接克隆进载体后，利用自身的起始密码子表达编码蛋白。有的载体其启动子后接有SD顺序，另一些载体其启动子后没有接SD顺序，需要目的基因上游带进。这种表达载体结构简单，所表达的产物为目的基因所编码的蛋白质序列。如pKK223－3质粒表达载体（图3－14）。

图3－14　完整蛋白表达载体pKK223－3

＊：非唯一酶切位点

2.融合蛋白表达载体　除了在大肠埃希菌中直接表达外源蛋白外，还可以在载体上带有一个蛋白质编码序列，将外源基因与载体自身蛋白编码基因拼接在一起，并作为一套阅读框架进行表达。载体启动子后连有SD顺序和起始密码子并表达另外一种多肽，目的基因按这个多肽的三联密码子阅读框插进多肽基因中的某一位点，表达出来的产物为载体部分多肽与目的蛋白杂合的融合蛋白。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收外源蛋白。

外源蛋白以融合蛋白方式表达的一个显著特点是其稳定性大大增加，而且在很多情况下，载体编码的多肽部分能维持整个融合蛋白分子的理想空间构象，使融合蛋白具有较高的水溶性，甚至某些外源蛋白的融合形式本身就已具有相应的生物活性，而且融合蛋白的表达率比较高。在构建融合蛋白表达系统时，所选用的受体菌通常是高效表达的，其SD序列的碱基组成以及与起始密码子之间的距离为融合蛋白的高效表达创造了有利的条件。另外，融合蛋白的分离纯化程序简单。由于载体编码蛋白的结构与功能通常是已知的，因此，可利用载体编码蛋白的特异性抗体、配体或底物的亲和层析技术迅速纯化融合蛋白。如果外源蛋白和载体编码蛋白的相对分子质量大小以及氨基酸组成差别较大，则可经酶法或化学法特异性水解后，进一步纯化外源蛋白。

目前较为广泛使用的外源基因融合表达系统有谷胱甘肽转移酶（GST）（图3－15）、麦芽糖结合蛋白（MBP）、金黄色葡萄球菌蛋白A以及硫氧化还原蛋白（TrxA）等。

图3－15　融合蛋白表达载体pGEX4T－1

3.外源蛋白的分泌型表达　在大肠埃希菌中表达的外源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质（细胞质与外膜之间的空隙），甚至穿过外膜进入培养基。如果融合蛋白中位于N端的载体编码多肽部分是细菌的分泌信号，则可促进融合蛋白定位于细胞周质空间或外膜，以实现其可分泌性（图3－16）。

图3－16　分泌型表达载体pINⅢ系统

大肠埃希菌分泌型表达外源蛋白有三大优点。

（1）外源蛋白分泌到周质空间会更稳定，例如重组人胰岛素原合成后若被分泌到细胞周质中，则其稳定性大约是在细胞质中的10倍。

（2）外源蛋白无论是被分泌到周质空间还是直接进入培养基，均可大大简化后续的分离纯化操作。

（3）高等哺乳动物体内绝大多数的成熟蛋白质在其N端是不含甲硫氨酸残基的。当这些蛋白质在大肠埃希菌中表达时，其重组蛋白N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将其与大肠埃希菌信号肽编码序列重组在一起，一旦使之分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽专一性剪切过程中被有效除去。

但是大肠埃希菌的蛋白分泌机制并不健全。外源蛋白很难在大肠埃希菌中进行分泌表达，少数外源基因即使能分泌表达，其表达率通常也很低。

由于大肠埃希菌的原核性，有为数不少的真核生物基因不能在大肠埃希菌中表达出具有生物活性的功能蛋白，其原因是：①大肠埃希菌细胞内不具备真核生物的蛋白质复性系统，许多真核生物基因仅在大肠埃希菌中合成出无特异性空间结构的多肽链；②与其他原核细菌一样，大肠埃希菌缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性恰恰依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用；③大肠埃希菌内源性蛋白酶易降解空间构象正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定；④大肠埃希菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。上述缺陷在一定程度上制约了重组大肠埃希菌作为微型生物反应器在异源真核生物蛋白尤其是药物蛋白大规模生产中的作用，因此，往往需采用真核细胞表达系统进行外源蛋白的表达。