－基因的克隆与表达

7．2．5　hMn－SOD基因的克隆与表达

在SOD家族中Mn－SOD的特点是：生物半衰期较长，抗炎抗辐射作用优于Cu，Zn－SOD；据报道，给予外源性Mn－SOD可抑制某些肿瘤细胞生长。这表明Mn－SOD作为酶制剂具有十分重要的医用价值和潜在的临床应用前景。但是，由于Mn－SOD主要分布于线粒体内，分离纯化方法繁琐，而且含量少造成来源困难，不能够满足研究及临床的需要。因此，开展重组人Mn－SOD（rhMn－SOD）的研制很有必要。RT－PCR是基因工程工作中获得外源基因的有效途径。

从研究现状来看，hMn－SOD基因工程的一些实验研究已经取得了可喜的成果。到目前为止，hMn－SOD基因已经在大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物等系统中得到表达。

Gorecki等将hMn－SOD于大肠杆菌中表达，表达量为25%，相对分子质量为22kD，在不加入金属离子的情况下，所表达的产物以不溶的包含体存在，而当在培养基中加入Mn^2＋后，则大部分可溶，产生有活性的Mn－SOD。

1994年Fujii等在杆状病毒/昆虫细胞系统中对hMn－SOD进行了表达，但是在传统的培养基中不显示酶活性，产生的是脱辅基酶蛋白，只有加入金属锰离子诱导才能充分激活Mn－SOD的活性，说明Mn^2＋对hMn－SOD的活性是必需的。此外，Mn^2＋还可增加线粒体中蛋白的积累量。因此认为Mn^2＋不仅参与活性中心的形成，而且与线粒体内酶的半衰期有关。

Wright将人Mn－SOD基因在昆虫sf9细胞中表达，表达量为15%～25%。1995年骆训懿等用RT－PCR，以人胎肝总RNA为模板，扩增了人Mn－SOD的cDNA片段，并将其克隆到载体pGEM－T中，对重组质粒进行了限制酶切分析和序列测定，得到含hMn－SOD cDNA的重组质粒，将此hMn－SOD cDNA重组到表达载体pBV220内，重组质粒在大肠杆菌DH5α中表达hMn－SOD，表达产物占菌体总蛋白的14%。

1999年，施惠娟等用RT－PCR法，以人肝细胞株总RNA为模板，扩增了hMn－SOD的cDNA，重组到T₇启动子控制下的表达载体pET－24α（＋）中，构建了表达质粒pETMn－SOD，并转化大肠杆菌BL21（DE3），经1mmol/L IPTG诱导，可高效表达一个相对分子质量为22kD的蛋白质，表达量约为菌体总蛋白质的50%，超声后上清中酶比活为387．5u/mg。通过摇瓶和发酵罐研究了培养基、乳糖诱导浓度、诱导时机、表达时间、溶氧条件、补料碳源种类对乳糖诱导rhMn－SOD表达的影响。结果表明乳糖诱导浓度为0．25%，溶氧浓度为40%～60%，用葡萄糖作为补料碳源进行高密度发酵，菌体密度OD₆₀₀达到28．98，菌体湿重达到60g/L，Mn－SOD活性达到7　800u/mL，比活为1　057．5u/mg。

rhMn－SOD有其自身特点，具有一定耐热性，选择75℃热变性法去除杂蛋白，这样就避免了硫酸铵沉淀的方法造成蛋白液中的离子强度过高而导致后续纯化不便。

Mn－SOD最有应用前景的功能是可以有效抑制肿瘤生长。越来越多的实验表明Mn－SOD基因可能是一种非特异性的肿瘤抑制基因，Mn－SOD已逐渐被公认为是一种新型肿瘤抑制因子，很可能在不久的将来应用于恶性肿瘤的治疗。