淋巴细胞的纯化

一、淋巴细胞的纯化

（一）外周血单个核细胞的分离

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）主要指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学检验中最常用的细胞群。PBMC的密度与血液中的其他细胞不同，血小板的密度为1.030～1.035，淋巴细胞和单核细胞的密度为1.075～1.090，粒细胞为1.092，红细胞为1.093。因此，利用一种密度介于1.075～1.092之间、近于等渗的分层液进行密度梯度离心，可使不同类别的血细胞按其相应密度成层分布，从而被分离。常用的分层液有聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque，F-H）分层液和Percoll分层液两种。其中聚蔗糖-泛影葡胺分层液进行单个核细胞分离的方法即Ficoll分离法是最常用的一种单次密度梯度离心分离技术。

【原理】

F-H分层液的密度为1.077±0.001，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），相对分子质量为40 kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重稍低于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，这样就可以获得PBMC。

【试剂与器材】

（1）比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺（商品名为淋巴细胞分离液）。

（2）Hank’s液（无Ca²⁺、Mg²⁺）、10％小牛血清ROM I1640。

（3）用生理盐水或等渗的PBS配制的0.2％台盼蓝染色液。

（4）用Hank’s液或生理盐水稀释成500 U/mL的肝素。

（5）短中管、毛细滴管、1 mL和10 mL刻度滴管、无菌干燥注射器针头、无菌棉球、镊子、止血带、血细胞计数板、显微镜、水平式离心机等。

（6）碘酒、75％乙醇等。

【操作方法】

（1）在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

（2）取肝素抗凝静脉血与等量的Hank’s液或RPM I 1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持的界面清楚，水平离心2 000 r/min，20 min。

（3）离心后，管内自上而下分为三层：上层为血浆、Hank’s液和血小板；下层主要为红细胞和粒细胞；中层为淋巴细胞分离液；在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带（图8-1）。

（4）用毛细滴管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank’s液或RPM I1640，1 500 r/min，离心10 min，洗涤细胞2次。

（5）末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPM I1640，混匀。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼蓝染色液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

图8-1　F-H分层液分离单个核细胞示意

【结果判断】

（1）单个核细胞浓度（细胞数/1 mL细胞悬液）=（4个大方格内细胞总数/4）×10⁴×2（稀释倍数）。

（2）细胞活力检测　死亡细胞可被台盼蓝染色液染成蓝色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞，计算出活细胞的百分率。

活细胞百分率=（活细胞数/总细胞数）×100％

本技术分离单个核细胞的纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，其中T细胞可达80％以上，其高低与室温有关，室温超过25℃时会影响细胞获得率。

【注意事项】

（1）抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。

（2）操作全程尽可能在短时间内完成，以免增加死细胞数。

（3）用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，以保持清晰的界面。

（二）去除红细胞

一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83％氯化铵处理法去除红细胞。

（三）去除血小板

将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。

（四）去除单核细胞

1.黏附去除法　单核细胞具有黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性，通过PBMC与玻璃或塑料平皿的黏附作用，采集的非黏附细胞即为淋巴细胞。亦可应用玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G-10柱，清除黏附细胞，洗脱液中主要是淋巴细胞。此法简便易行，对细胞损伤极小，缺点是B细胞也有较弱的黏附能力，因此会有部分B细胞丢失。该法去除单核细胞后，大约95％的单个核细胞为淋巴细胞。

2.羰基铁粉吞噬法　单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大，在经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，沉积于管底而被除去。也可在PBMC悬液内加入羰基铁粉颗粒，待单核细胞充分吞噬羰基铁粉后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含有较纯的淋巴细胞。