淋巴细胞转化实验

实验27　淋巴细胞转化实验

(Lymphocyte transformation test)

【目的】

1.掌握淋巴细胞转换实验的原理和方法。

2.熟悉淋巴细胞的形态特征。

【原理】

体外培养的淋巴细胞在特异性抗原或非特异性有丝分裂原的刺激下，可转化为淋巴母细胞。PHA是最常用的物质，根据PHA刺激T细胞分裂的程度，可以间接估计T细胞识别特异性抗原的增殖反应程度，从而反映机体的免疫功能。

【材料】

1. Wright-Giemsa染液。

2.细胞培养液:多用RPM I1640。按说明书配制后抽滤除菌，临用前加入20％无菌NBS、PHA 50～200μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml。

3.肝素(400单位/ml，用Hanks液配制)、0.5m l可抗凝血5m l。

4. 2.5％碘酒、75％酒精。

5.载玻片、无菌棉签、无菌注射器5ml及7号针头、毛细滴管、培养瓶、高压灭菌器、CO₂孵箱或恒温培养箱、水平离心机、无菌过滤器、各种吸管、超净台。

【方法】

1.灭菌器材:将注射器及针头、吸管、培养瓶等高压灭菌［0.103MPa(15磅/吋²) 20min］。

2.分装培养液于各培养瓶中，每瓶2ml。

3.抽取静脉血0.2ml，无菌操作注入培养瓶内，立即摇匀，置37℃、5％CO₂孵箱培养72h，期间每天旋转摇匀1次，使细胞充分混匀。

4.培养后，摇匀细胞，倒入离心管内，1000r/min离心10min。

5.由于大的细胞离心后居上层者较多，只吸上层细胞推片计数，结果易偏高。所以准确计数方法是在倒净上清液后，待残留及管壁的少量液体回流至管底后，用毛细滴管吹打将管内细胞打散，置1滴于玻片上，用毛细滴管前端刮片，均匀分布于全片，染色，按头、体、尾三段各1～2纵列(计数走向似城墙形)进行计数，以减少分布不均带来的误差，每片计数100～200个淋巴细胞。记录转化和未转化的淋巴细胞数，求出转化率。

【结果】

1.用形态学方法判断转化率，掌握淋巴细胞的形态学至关重要，应根据细胞的大小、核与浆的比例、胞浆的染色性、核结构和核仁的有无等特征进行判别。

(1)成熟的小淋巴细胞:与未培养的小淋巴细胞一样为6～8μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。

(2)过度型淋巴细胞:比小淋巴细胞大，约10～20μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别的要点。

(3)淋巴母细胞:细胞体积增大，为20～30μm，形态不整齐，常有小突起，核变大，核质染色疏散，有明显核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。

(4)其他细胞:如中性粒细胞在培养72h后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。

2.结果计算

转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞，未转化的淋巴细胞指成熟的小淋巴细胞，在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60％～80％，如为50％～60％则偏低，50％以下则为降低。

【注意事项】

1.本实验要求严格无菌操作，否则会影响实验结果。

2.PHA的加入量要适当，过多或过少都会影响转化率。一般需根据不同的厂家、批号及实践经验定量。

【思考题】

1.淋巴细胞转化前的形态特征是什么?

2.淋巴细胞转化试验的理论基础和实际意义是什么?